构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验（基本方案3 将外源基因序列插入到复制缺陷性基因组人类单纯疱疹病毒（HSV)载 体）
材料与仪器IE 基因补充细胞 复制缺陷性 HSV 载体 带外源基因的质粒 在24孔板中单层培养IE基因补充细胞系完全改良的基础培养基 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水
材料与仪器
IE 基因补充细胞 复制缺陷性 HSV 载体 带外源基因的质粒 在24孔板中单层培养IE基因补充细胞系
完全改良的基础培养基 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水 DNA 抽提缓冲液 苯酚 氯仿 异戊醇 氯仿 异丙醇 乙醇 总 RNA 分离试剂 1-溴-3-氯丙烷 核糖核酸酶 反转录酶及其缓冲液 DTT 外源基因引物对 三磷酸脱氧核苷混合物 胎盘 RNA 酶抑制剂 灭菌水 10 X PCR 扩增缓冲液
外源基因序列的 DNA 探针 Taq DNA 聚合酶 摇床 组织培养皿 96孔平板及24孔组织培养板 微量离心管 研磨杵
完全改良的基础培养基 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水 DNA 抽提缓冲液 苯酚 氯仿 异戊醇 氯仿 异丙醇 乙醇 总 RNA 分离试剂 1-溴-3-氯丙烷 核糖核酸酶 反转录酶及其缓冲液 DTT 外源基因引物对 三磷酸脱氧核苷混合物 胎盘 RNA 酶抑制剂 灭菌水 10 X PCR 扩增缓冲液
外源基因序列的 DNA 探针 Taq DNA 聚合酶 摇床 组织培养皿 96孔平板及24孔组织培养板 微量离心管 研磨杵
步骤
![18. 测定病毒株的滴定度（ 支持方案2)。 1 9 . 任意：为了进一步纯化病毒， P B S 重悬沉淀，蔗糖、 T -1 0 葡聚糖或Nycodenz梯度 纯 化 （ 如 C P M B U N I T 16.11)。 储存前加入1 0 % 的甘 油 。 蔗 糖 梯 度 纯 化 是 用 线 性 3 0 % 〜 6 5 % 梯 度 ， 4°C ， 71 OOOg 离 心 16h D 支 持 方 案 2 噬 菌 斑 分 析 测 定 病 毒 滴 定 度 本分析试验需重复2 或 3 次。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 适合于病毒生长的受体细胞 用于滴定的病毒株 V 完全改良的基础培养基/10% (V /V ) F B S 及无血清培养基（ 完全M E M /10% F B S 及完全M E M ) V l % W V ) 甲基纤维素 V I % W V ) 龙胆紫溶液 12孔组织培养板 1. 将 I.O X l O 5 个受体细胞种植于1 2 孔组织培养板中。孵育过夜直至细胞形成几近汇 合的单层细胞。 2. 第二天，制备含10倍稀释浓度（K T 5〜10-ltO 病毒Iml完全无血清M E M 。将双份 1(%1稀释液到受体细胞孔中。 37°C 孵育60〜9Omin使病毒吸附，每隔l5min 摇晃一 次板子4 种植物平衡分布。 3. 吸附反应后，抽吸病毒接种物。加人Iml 1.0%甲基纤维素覆盖。孵育3〜5d 直到界 限清晰的斑点出现。 4. 当斑点清晰可见时，抽吸甲基纤维素。用 Iml 1 % 龙胆紫室温染色5m m 。 5. 抽吸染液，用自来水轻柔冲洗板子去除过量的染色液。自然晾干。 6 . 计算每个孔的斑点数。确定每个稀释孔中斑点的平均数，乘 以 10得到各个稀释孔 每毫升斑点形成单位数。这个数值在乘以10到稀释倍数得到病毒株每毫升噬斑形成 单 位 （pfu/ml) 的滴定度。 支 持 方 案 3 分 离 病 毒 DNA 病毒D N A 的转染性是通过计算病毒D N A 转染进人受纳细胞后每微克病毒D N A 产生的斑点数的比率来衡量。纯化病毒D N A 使每毫克纯化的病毒D N A 100〜1000个 斑点。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 单层受体细胞，培养于150cm2组织培养瓶及60m m 组织培养皿 已知滴度的H S V -I 病 毒 株 （ 支持方案1) V 兀全改良基本培养基/10% F B S 及天血清完全改良基本培养基（ 完全]yiEM/10% F B S 及完全无血清M E M )](/uploads/allimg/20240622/1-240622120609246.jpg)
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