免疫细胞化学ICC

【材料】样品， 【试剂，试剂盒】冷甲醇、丙酮，冷 PBS，Hoechst 或 DAPI（DNA 染色剂）， BSA ，Triton X-100

1.   固定 1)   冷甲醇、丙酮固定样品 1-10 分钟，或含 3-4% 多聚甲醛 pH 7.4 的 PBS 室温固定 15 分钟。 2)   冷 PBS 冲洗样品 2 次。 2.   通透 1)   将样品在含 0.25% Triton X-100 (或 100 μM 洋地黄皂苷或 0.5% 皂角苷)的 PBS 中孵育 10 分钟。Triton X-100 是最常用的去污剂，能增强抗体的穿透力。因为它对细胞膜有损坏作用，因此不适用于与细胞膜结合的抗原。 2)   PBS 冲洗细胞 3 X 5 分钟。 3.   封闭及孵育 1)   细胞在含 1% BSA 的 PBST 中孵育 30 分钟，以阻断抗体的非特异性结合（封闭液也可以选择含 1% 明胶或 10% 与二抗同种动物来源的血清）。 2)   细胞与抗体（含 1% BSA 的 PBST 稀释）在湿盒中共同孵育，室温 1 小时，或 4 °C 过夜。 3)   弃去液体，PBS 冲洗细胞 3 X 5 分钟。 4)   细胞与二抗在 1% BSA 中孵育，室温 1 小时，避光。 5)   弃去二抗溶液，PBS 冲洗细胞 3 X 5 分钟，避光。 4.   复染 1)   0.1-1 μg/ml Hoechst 或 DAPI（DNA 染色剂）孵育细胞 1 分钟。 2)   PBS 冲洗。 5.   封固 1)   向盖玻片上滴加一滴封固液封固。 2)   用指甲油密封盖玻片防止变干并移至显微镜下观察。 3)   -20 °C 或 4 °C 避光保存。