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DNA实验

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)

2024-09-26 DNA实验 加入收藏
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白,并可通过加入特异性的抗体(supershift)来检测特定的蛋白质,并可进行未知蛋白的鉴定。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

Lane 1 2 3 4 EBNA Extract - + + + Unlabeled EBNA DNA - - + - Unlabeled Oct-1 DNA - - - +

Figure . EMSA results using the EBNA control system. Biotin-labeled 60 bp duplex bearing the EBNA-1 binding sequence was incubated with an extract in which the EBNA-1 protein was overexpressed. The binding buffer was supplemented with 50 ng/µl poly(dI•dC), 10% glycerol and 0.05% NP-40. Exposure time was 30 seconds with X-ray film


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