CaCl2法大肠杆菌的感受态细胞的制备

一、实验目的与意义 学习使用CaCl2法制作大肠杆菌感受态细胞，使学生掌握感受态细胞制作的基本原理和操作技术。 二、实验原理 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 受体细胞经过一些特殊方法[如电击法，CaCl2，RbCl（KCl）等化学试剂法]的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法为使用更广泛。 为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素： 细胞生长状态和密度：菌株生长至OD600 为0.5时，细胞密度在5×107 个/ml左右（不同的菌株情况有所不同），这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 三、实验仪器

四、实验材料  培养过夜的DH5ɑ菌株 无菌枪头1ml， 200μL各10支 1.5ml 离心管（无菌）每人4只