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细胞技术

基因转染实验(磷酸钙-DNA共沉淀法)

2024-09-19 细胞技术 加入收藏
核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有1%~5 %

核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有1%~5 %可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液

(1)2×HBS1.63g NaCl1.19g Hepes0.023g Na2PO4•2H2O加水至100ml pH7.1过滤,4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

(3)TE0.1mmol/L EDTA1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液:1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基:用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418,G418浓度为200~ 800mg/L

注意:对受体细胞先做预试验,选用浓度为在10~14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步骤:

(1)供体DNA制备:方法按前介绍的DNA提取法提取,溶于TE中,40mg/L。

(2) 受体细胞的培养:研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等,该细胞有一定自发转化倾向,一般在转染前一天接种细胞,接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液,37℃、5%CO2培养,待细胞占50~70%瓶底面积时,用于转染试验。

(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备

①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液,同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1~2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中,缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。

③然后立即混旋,室温下静置30分钟,待溶液轻度混浊后,吹打后即用于转染受体细胞。

(4)转染受体细胞

①将处于对数生长期已占瓶底50~70%的受体细胞,在转染前4小时更换一次新鲜培养基,每瓶5ml(25ml培养瓶)。

②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀,加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。

③置37℃ 5% CO2培养24h或更长,使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。


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