基因转染实验(磷酸钙－DNA共沉淀法)

核酸以磷酸钙－DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%~5 %可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液

（1）2×HBS1.63g NaCl1.19g Hepes0.023g Na2PO4•2H2O加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存

（2）2mmol/L CaCl2 过滤除菌

（3）TE0.1mmol/L EDTA1mmol/L Tris-HCL PH8.0

（4）G418（新霉素G418）液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

（5）G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200~ 800mg/L

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10~14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步骤：

（1）供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

（2） 受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2，用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50~70%瓶底面积时，用于转染试验。

（3）DNA－磷酸钙沉淀物的制备

①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液（20mg/L）220μl和2×HBS 250μl（PSV2-neo为1~2mg/L的使用量）。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。

③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。

（4）转染受体细胞

①将处于对数生长期已占瓶底50~70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。

②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。

③置37℃ 5% CO2培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。