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细胞技术

DNA的转化

2024-09-19 细胞技术 加入收藏
实验原理:体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒,选用转化和筛选技术, 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中,DNA可在生物体系中大量扩增,繁殖,

实验原理:

体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒,选用转化和筛选技术, 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中,DNA可在生物体系中大量扩增,繁殖, 保存以及表达目的基因的产物,这是PCR体外扩增DNA所不能替代的。配合DNA重组技术,所获得的,不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研,医药生产和生物发酵等领域。

质粒转化不同细菌有不同的转化效率,转化效率的高低与实验的成败直接相关, 通常转化效率可达105-107转化子/μg DNA。获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态,只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。

pUC18的LacZ基因区域当有DNA片段插入时,LacZ基因失活,转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal培养基生长时,会产生白色的克隆,不含插入片段的pUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。

DNA分子转化分以下几步:

1、 吸附--双链DNA分子吸附于受体菌表面;

2、 转入--双链DNA分子解链。一条链进入受体菌,另一条降解;

3、 自稳--外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链;

4、 表达一供体基因随同复制子同时复制,分裂, 转录翻译。

实验试剂:

LB培养基

质粒DNA(含Amp抗生基因),受体菌

CaCl2 0.1M

Amp

实验过程:

1、 感受态细胞制备及CaCl2处理:

1) 将宿主菌在琼脂培养基平板上划线,37℃培养16~20小时。

2) 挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中,37℃振荡过夜。

3) 从中取2ml菌液转入50ml LB培养基中37℃振荡培养4-5小时, 测OD100达0.4~0.5。

4) 培养物于冰上10分钟。

5) 转入-50ml离心管,于4000rpm下4℃离心10分钟。

6) 弃上清,倒置离心管1分钟,流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2,置冰上10分钟。

7) 4,000rpm 4℃离心10分钟,弃上清。

8) 加入2ml,0.1M CaCl2悬浮细胞,于4℃过夜。

2、 倒皿铺平板 :

1) 按照各组转化反应的混合物,控制不同的选择性培养基(20 ml/皿) 。LB固体培养基(100 ml) Amp(60μg/ml) Tet(40μg/ml)供连接混合物转化,pUC18转化用, 共5皿 LB固体培养基 (100 ml) Amp (60μg/ml) X-gal (40μg/ml) IPTG(24μg/ml),供连接混合物转化,pUC18转化用,共5皿 。

2) 转化反应前一天,先铺好平板 。

3) 取各组反应物在平板上涂布 。

4) 培养皿倒置于37℃培养箱中过夜 。

5) 观察转化子出现的情况 。

3、 转化:

1) 将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记,温和混匀,于冰上30分钟

2)于42℃水浴90秒。

3) 冰浴2分钟。

4) 加入800μl LB 液体培养基37℃ 45分钟。

5) 分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布,室温下干燥,然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

注意事项:细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力,因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞,当细菌大量增殖的同时,导入的重组DNA也得到增殖。


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