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细胞技术

hoechst 染色(贴壁细胞)

2021-07-28 细胞技术 加入收藏
简介Hoechst 是一种可以穿透细胞膜的膜通透性荧光染料,在嵌入双链 DNA 后释放蓝色荧光,故正常细胞和中早期凋亡细胞均可被 Hoechst 着色。Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 均为非嵌人性荧光染料,Hoechst 33258 常用于细胞凋亡检测,多用于活细胞染色。Hoechst 33342 活细胞和死细胞均可,Hoechst 33342 能透过胞膜完整的细胞嵌入

简介

Hoechst 是一种可以穿透细胞膜的膜通透性荧光染料,在嵌入双链 DNA 后释放蓝色荧光,故正常细胞和中早期凋亡细胞均可被 Hoechst 着色。

Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 均为非嵌人性荧光染料,Hoechst 33258 常用于细胞凋亡检测,多用于活细胞染色。Hoechst 33342 活细胞和死细胞均可,Hoechst 33342 能透过胞膜完整的细胞嵌入细胞核 DNA 使之发出明亮的蓝色荧光。

凋亡的细胞核染色增强,荧光更为明亮,呈圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异,很易区别判别。

原理

Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 在活细胞中 DNA 聚 AT 序列富集区域的小沟处与 DNA 结合。

正常细胞核 Hoechst 染色的形态呈圆形,淡蓝色,内有较深的蓝色颗粒,而凋亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状。

活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料,从而使细胞核着色,故又把此类染料称为 DNA 探针。Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 均可溶于水并在水溶液中保持稳定。

Hoechsr-DNA 的激发和发射波长分别 550 nm 和 460 nm。在荧光显微镜紫外光激发时,Hoechst-DNA 发出亮蓝色荧光。

用途

观察细胞形态和细胞的凋亡鉴定。

材料与仪器

普通洁净盖玻片、70% 乙醇、4% 多聚甲醛、无菌超净台、PBS、细胞培养液、盖玻片、六孔板、细胞固定液、Hoechst 染色液、显微镜。

步骤

1、取普通洁净盖玻片于 70% 乙醇中浸泡 5 分钟或更长时间,无菌超净台内用细胞培养级 PBS 或 0.9% NaCl 洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内,加入细胞培养过夜。

2、待细胞长到 80% 左右,刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入 4% 多聚甲醛固定液,固定 10 分钟或更长时间(可 4 ℃ 过夜)。

3、去固定液,用 PBS 洗两遍,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。

4、加入终浓度为 10 ug/ml 的 Hoechst 染色液,染色 5 分钟。也宜用摇床,或手动晃动数次。

5、用 PBS 洗三遍。

6、将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上。

7、荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。

注意事项

1、过程需要无菌;

2、盖玻片时小心,不能产生气泡或者正反颠倒;

3、染液对人体有一定刺激性,请注意适当防护;

4、荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽量当天完成检测;

5、Hoechst 33342 对细胞的毒性作用更小一些,因此一般 Hoechst 33258 用于细胞固定后再染色,而 Hoechst 33342 则可以对活细胞直接进行染色。


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