hoechst 染色（贴壁细胞）

Hoechst 是一种可以穿透细胞膜的膜通透性荧光染料，在嵌入双链 DNA 后释放蓝色荧光，故正常细胞和中早期凋亡细胞均可被 Hoechst 着色。

Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 均为非嵌人性荧光染料，Hoechst 33258 常用于细胞凋亡检测，多用于活细胞染色。Hoechst 33342 活细胞和死细胞均可，Hoechst 33342 能透过胞膜完整的细胞嵌入细胞核 DNA 使之发出明亮的蓝色荧光。

凋亡的细胞核染色增强，荧光更为明亮，呈圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易区别判别。

Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 在活细胞中 DNA 聚 AT 序列富集区域的小沟处与 DNA 结合。

正常细胞核 Hoechst 染色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒，而凋亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状。

活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料，从而使细胞核着色，故又把此类染料称为 DNA 探针。Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 均可溶于水并在水溶液中保持稳定。

Hoechsr-DNA 的激发和发射波长分别 550 nm 和 460 nm。在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA 发出亮蓝色荧光。

观察细胞形态和细胞的凋亡鉴定。

普通洁净盖玻片、70% 乙醇、4% 多聚甲醛、无菌超净台、PBS、细胞培养液、盖玻片、六孔板、细胞固定液、Hoechst 染色液、显微镜。

1、取普通洁净盖玻片于 70% 乙醇中浸泡 5 分钟或更长时间，无菌超净台内用细胞培养级 PBS 或 0.9% NaCl 洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，加入细胞培养过夜。

2、待细胞长到 80% 左右，刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入 4% 多聚甲醛固定液，固定 10 分钟或更长时间（可 4 ℃ 过夜）。

3、去固定液，用 PBS 洗两遍，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

4、加入终浓度为 10 ug/ml 的 Hoechst 染色液，染色 5 分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。

5、用 PBS 洗三遍。

6、将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上。

7、荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。

1、过程需要无菌；

2、盖玻片时小心，不能产生气泡或者正反颠倒；

3、染液对人体有一定刺激性，请注意适当防护；

4、荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测；

5、Hoechst 33342 对细胞的毒性作用更小一些，因此一般 Hoechst 33258 用于细胞固定后再染色，而 Hoechst 33342 则可以对活细胞直接进行染色。