FISH 技术基本实验基本方案

一、制备培养的中期细胞标本

1.在一个独立小室里放置一个水浴锅和一台增湿器。湿度应大约50%，如果房间湿度计显示低于45%，则应使用加湿器。

2.预热水浴锅至67℃±2℃，在水浴锅中央放置试管架以使碰不到水浴锅边缘，整个操作过程保持水位刚好在试管架顶端之下。

3.用Carnoy固定液调整细胞悬液的浓度，使悬液轻度混浊即可

4.用70%乙醇清洗载玻片的两面，用无尘纸将玻片擦干。

5.将清洗过的玻片浸在一缸水中，倾斜载玻片使水均匀覆盖在片子上表面。

6.立刻将片子移至水浴锅上方，拿一支2〜4in(1in=2.54cm)的巴斯德吸管，在片子上方沿片子长边滴3或4滴细胞悬液。

7.将片子放置在水浴中试管架的顶端，有标本面向上，让片子干燥5〜10min.

8.将片子拿开，在相差显微镜下观察，必要时调整滴片条件。

二、使用可调节细胞遗传干燥器制备中期染色体标本

1.打开温差电偶真空计，将温度设定为22℃和相对湿度设定为44%，并使之达到稳定状态。

2.用Camoy固定液调整细胞浓度，使悬液呈微混浊状。

3.用70%乙醇清洗载玻片两面，并用无尘纸擦干，将片子放置在温差电偶真空计的内表面。

4.握住一支2〜4in巴斯德吸管，在片子正上方沿着片子的长边滴3或4滴细胞悬液。

5.观察悬液干燥的情形。悬液在45〜60s内干燥的情况下制备的标本质量一般较好。

6.在相差显微镜下观察，必要时调整滴片条件。

三、制备未经过培养的标本

1.小心重悬固定的细胞。

2.每个杂交区域滴15〜20uL细胞悬液（通常每张片子滴两个区域）

3.气干标本。

4.在相差显微镜下检验细胞密度，如有必要重复2和3步。

5.过夜老化或在73℃的2\SSC溶液中保温2min。

四、制备尿道上皮细胞标本

1小心重悬细胞并分别滴3uL、10uL和30uL悬液在加盖载玻片的3个孔中。

2.气干标本。

3.确定哪个样品的细胞密度最佳，即拥有足够数量的非重叠细胞。

4.在相差显微镜下面观察细胞密度，并选择合适的孔进行杂交。

5.过夜老化或在73℃的2XSSC溶液中保温2min。

五、新鲜细胞的预处理

1.将标本在73℃的2XSSC中浸泡2min。

2.将标本在37℃的胃蛋白酶工作液中浸泡10min

3.将标本在室温的PBS中洗5min。

4.室温下将标本在处理后固定液中放置5min。

5.将标本在室温的PBS中洗5min。

6.将标本自然风干。

7.将标本在70%的乙醇中室温下浸lmin。

8.将标本在85%的乙醇中室温下浸lmin。

9.将标本在100%的乙醇中室温下浸lmin。

10.可以进行标本变性。

六、石蜡标本的预处理

1.用钻石笔标出待杂交的石蜡区域。

2.室温下将标本在Hemo-De清理试剂中浸lOmin。

3.将标本在Hemo-De清理试剂中重复洗2次，每次都使用新鲜的Hemo-De清理试剂。

4.室温下，将标本在100%乙醇中脱水5min。

5.换新的乙醇重复步骤4。

6.将标本自然风干或将片子在45〜50℃的片子加热板上放置2〜5min。

7.将标本在0.2mol/L HCl中浸20min。

8.将标本在纯水中浸3min。

9.将标本在洗脱缓冲液中浸3min。

10.将标本在80℃预处理液中浸30min。

11.将标本在纯水中浸1min。

12.将标本在洗脱缓冲液中浸5min。

13.重复在洗脱缓冲液中清洗步骤。

14.用纸巾从载玻片边缘蘸去多余的洗脱缓冲液。

15.将标本在37℃的蛋白酶溶液中浸泡10min。

16.将标本在洗脱缓冲液中浸5min。

17.重复在洗脱缓冲液中清洗步骤。

18.将标本在45〜50℃的标本电热板上干燥2〜5min。

19.将标本在中性福尔马林缓冲液中室温浸泡10min。

20.将标本在洗脱缓冲液中浸5min。

21.重复在洗脱缓冲液中清洗步骤。

22.将标本在45〜50℃的标本电热板上干燥2〜5min。

23.可继续进行杂交操作程序。

七、杂交和洗脱。

一定要协调好准备探针的时间和标本变性时间，以便同时完成以备杂交。

1.将标本在73℃变性液中浸泡5min。一个染缸内一次最多变性4〜6张载玻片。

2.将标本浸在室温的70%乙醇中lmin。

3.将标本浸在室温的85%乙醇中1min。

4.将标本浸在室温的100%乙醇中1min。

5.用吸水纸从载玻片的边缘吸取多余的乙醇并用纸巾将玻片背面擦干。

6.将探针分装到一个微量离心管中并盖紧，将探针在73℃水浴中变性5min。

7.在标本上的目标区域加3〜10μL(根据样品区域而定）探针混合液

8.立刻在探针上覆盖以22mmX22mm或一个12mm圆形盖玻片使探针均匀分布。

9.用橡皮泥封住盖玻片周边。

10.将标本放在37℃预热的湿盒中。

11.将杂交标本在37℃保温过夜（14〜18h)。

12.用镊子轻轻撕除封片胶。

13.室温下，将标本浸在杂交后洗脱缓冲液中并洗掉盖玻片。

14.从载玻片的一端吸除过量的液体。

15.将载玻片在73℃的杂交后洗脱缓冲液中浸洗2min。每个染缸一次不得洗脱超过4〜6张非福尔马林固定的标本，在2XSSC/0.1%NP-40中室温浸洗1min。

16.取出片子，将片子垂直放置于暗处风干。

17.加10jaLDAPI复染液到目标区域并盖上22mmX22mm盖玻片。

18.杂交后标本置于暗处保存。不使用时于-20℃保存。

八、间期细胞的信号计数

使用下列各项标准评估片子是否合适。

1.探针信号强度：信号应该是明亮、清晰和易于评估。信号应该是紧密的椭圆形或线状、弥散的椭圆形。

2.背景：背景应该呈深暗或黑色，很少有荧光颗粒或是雾状

3.靶信号的识别：使用指定的滤光片。调整焦距，而且要熟悉靶信号和背景噪声(碎片）的大小和形状。

4.使用40X目镜，扫描一些区域估计细胞类型的异质性。选择一个核分布均匀的区域，避幵靶信号弱的区域。

5.使用63X或100X目镜，开始分析选定区域左上象限，并从左向右扫描，依照指导原则在每个清晰可辨的间期细胞核边界内计数信号。

6.上下调节焦距找到核内所有信号。

7.大小相同，相距小于或等于单个信号直径可计为两个信号。

8.不要对没有信号或当使用两种或更多不同荧光素只有一种颜色信号的核进行计数。只记人那些每种颜色有一个或多个FISH信号的核。

1.虽然煮沸TE探针溶液可进行变性，但为了更好地保持组织、细胞和染色体的形态应采用更温和的一些方法。染色质内DNA变性程度高低还依赖于对：Tm值这一参数的充分理解，Tm被定义为50%的DNA呈单链状态的温度。Tm值的大小依赖于GC含量、单价阳离子浓度和双链长度样品变性温度须远远超过Tm值，使近100%的DNA呈单链状态，典型的变性条件是在70〜75°C的50%〜55%甲酰胺/2X SSC溶液。通常探针和样品同时在玻片上变性，这就提供了快速形成杂合双链更加有利的动力学条件。如果变性条件远远髙于这些条件，可产生广泛的斑状杂交式样，这是紧密的DNA-组蛋白结构解螺旋的结果。充分固定可在某种程度上避免此种状况。相反，如果DNA链变性不充分，就会产生少量或无杂交信号的结果。

2.封闭DNA的性质不同取决于探针的复杂程度。高重复序列DNA探针，如着丝粒或近着丝粒DNA须在10〜100倍的过量人类基因组总DNA存在下进行杂交。如果探针包含某染色体臂特定区域的单一序列，须在含相似量的过量高度重复DNA的情况下进行杂交；这种高度重复DNA，即Cot-1DNA，它由高度重复的a序列和中度重复序列（如Aki重复序列家族）组成Alu重复序列家族存在于所有染色体实际上也存在于所有用来制备探针的基因组DNA片段中。

3.杂交时间的长短由探针序列的复杂性而定。由相当大一部分为单一序列的探针通常需要37℃过夜，而包含着丝粒或着丝粒周边围卫星序列的探针只需要在37〜42°C杂交几个小时。为了区分出极相关的重复序列可以稍稍改变杂交温度，不过可通过高严紧度洗脱有效消除交叉杂交。石蜡包埋的标本使用高盐洗脱液即可达到与非石蜡包埋的标本在较高严紧度洗脱相似的特异性，这是因为福尔马林固定标本的探针与靶杂交体的熔点较低，原因可能在于降解使靶序列太短或杂交区域蛋白质的稳定存在使杂交体不稳定。