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DNA实验

原核表达之目的基因克隆

2024-09-26 DNA实验 加入收藏
1. 了解实验课题对目的蛋白的要求:包括:目的蛋白分子量有多大,表达目的(是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体,不同目的对蛋白要求不同);是否要其可溶;是胞内表达还

1. 了解实验课题对目的蛋白的要求:

包括:目的蛋白分子量有多大,表达目的(是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体,不同目的对蛋白要求不同);是否要其可溶;是胞内表达还是分泌表达,是组成型表达还是诱导型表达;另外,还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化,纯化标签有多大,蛋白纯化后是否需要将标签去除(即标签的存在是否会影响蛋白的活性)。

还要对目的蛋白进行稀有密码子(仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考,注意稀有密码子的多少,位置5位或3位,稀有密码子是否成串出现等)和可溶性网上预测等。

综合以上,选取合适的表达载体及宿主菌。

注意:不是所有的标签都是用来纯化蛋白的,有的标签有促进蛋白溶解的作用,有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。

一般我们最常用的是胞内诱导型表达(即蛋白翻译后是存在于细胞内,通过加诱导物的方法来控制表达水平)。

2. 搜索要表达的目的基因的序列,根据其编码区序列来设计引物;

注意:要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点(首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点),并通过查阅资料看两种酶(上下游引物分别加入酶切位点)是否可以在同一反应体系中起作用,并注意标签序列是在N端还是在C端,若要在C端保留标签,则需要将下游引物的终止密码子替换掉;若要在引物上引入标签序列,则引物上应加入标签序列碱基(即在上游引物或下游引物处引入His的密码子);另外,还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变;

1,2步的分析至关重要,只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。

3. 摇菌,进行RNA抽提(注意选取不同表现型的菌株),摇菌的时间一定不要太长,太长的话RNA活性不高;

4. mRNA反转成cDNA(此步应在第三步完成后立即操作,RNA存放时间长易降解);

5. 以cDNA为模板,利于设计好的引物进行PCR扩增;

6. 通过胶回收试剂盒回收目的DNA片段。


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