实验小窍门

对于经历了硕士. 博士以及博士后磨练的前辈们. 大家肯定都有自己的科研体会和实验技巧的窍门或者"绝活". 这些窍门有的可能是书本上学不到的。对于新入实验室的师弟师妹们来说. 听听师兄师姐们的实验心得可以使自己更快进入科研角色. 避免走很多弯路。

经验一

形态学方法

免疫组织化学

实验对象：冰冻切片

步骤

1. 室温下复温30 Min. 0. 01 M PBS清洗5 Min×3；

2. 加入配好的0. 3% Triton X100（30% Triton X100＋0. 01 MPBS 100 Ml）30 Min. 以增加细胞的通透性. 0. 01 MPBS清洗5 Min×3；

3. 5%小牛血清封闭1 h0. 01 MPBS清洗5 Min×3；

3. 加入用血清稀释液（牛血清白蛋白 1. 00 g＋0. 01 MPBS 100 Ml)稀释的一抗. 4 ℃存放24-48 h；吸去抗体. 0. 01 MPBS洗5 Min×3；

4. 加入配好的0. 3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80 Ml＋0. 01 MKPBS 100 Ml＋30%过氧化氢）30 Min. 以消除内源性过氧化物酶的影响. 0. 01 MPBS清洗5 Min×3；

5. 加入0. 01 MPBS稀释的的二抗. 室温孵育2 h。0. 01 MKPBS洗5 Min×3；

6. 加入ABC复合物之类的抗体. 室温孵育2 h. 0. 01 MPBS洗5 Min×3；蒸馏水迅速冲三次；

7. 加入显色液. 进行免疫组织化学显色. 时间一般不超过30 Min. 可不时在显微镜下进行观察. 待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液. 用蒸馏水迅速冲三次后加入0. 01 MKPBS终止反应；

8. 梯度酒精脱水之后. 封片. 拍照。

细节将消除内源性过氧化物酶这一步放在后面. 能避免双氧水对目的蛋白的影响

经验二

（1）实验技术大类：

免疫测定与诊断技术

（2）具体实验技术名称：

ELISA

（3）实验对象：

肿瘤病人血清标本

（4）简要步骤:① 包被：用包被缓冲液将 MBP/OY-TES-1稀释至1. 0μ g/ Ml. 取100μl/孔包被酶标板. 4 ℃湿盒过夜。1×PBS-T洗板3次（室温静止30sec/次）. 甩去液体. 用纸吸干；

② 封闭：5%脱脂奶（200μl/孔）37 ℃封闭30 Min. 1×PBS-T洗板4次. 甩去液体. 用纸吸干；

③ 上血清：加入待检稀释血清（1:400）. 阳性对照和空白对照各100μl/孔. 37 ℃湿盒孵育1 h. 1×PBS-T洗板4次. 甩去液体. 用纸吸干；

④ 上二抗：加入Biotin-绵羊抗人I g g单克隆抗体（1:1000）. 37 ℃湿盒温育1 h. 1×PBS-T洗板4次. 甩去液体. 用纸吸干；

⑤ 上标记物：加入Avidin- hRP（1:1000）. 37 ℃湿盒温育30 Min. 1×PBS-T洗板4次. 甩去液体. 用纸吸干；

⑥ 显色：T MB避光显色15 Min. 加1N h2SO4终止反应；

⑦ 酶标仪OD450与OD630双波长读数。

（5）我的窍门或者心得体会：1. 我没用试剂盒做（尚未有商业化试剂盒开发）. 所以一切数据都要自己计算. 包括包被蛋白浓度. 一抗浓度. 二抗浓度. 计算时务必不能出错. 要不就会功亏一篑。

2. 用任何试剂前都要把试剂混匀. 因为蛋白是很容易沉淀的。

3. 用固定的几把移液器. 这样可以尽可能的较少误差。

4. 湿盒孵育前要先把湿盒放在37°进行温度平衡. 这样可以减少达到平衡的时间. 而且也可以避免符合试验温度的孵育时间不够。

5. 等板底的水珠挥发以后再读数. 要不会出现负值。

6. 实验时尽量少开口说话（因为大部分做的是蛋白的测定. 口水避免不了会使所测蛋白降解的啊. 呵呵）

经验三

1）实验技术大类：

动物建模

（2）具体实验技术名称：

早产儿视网膜病变动物模型建立

（3）实验对象：

C57BL/6J小鼠

（4）模型制作：高氧组幼鼠与哺乳母鼠一起置于密闭容器内. 氧气的流量控制在0. 5～1. 0 L/ Min. 使容器内氧气分压控制在75%±2%. 期间用测氧仪持续监测容器内的氧分压；每2 d打开氧箱更换垫料. 加食. 换水. 替换母鼠。在此高氧环境中饲养5 d. 5 d后即出生第12 d (P12) 返回正常空气环境中继续与母乳共同饲养。对照组幼鼠与哺乳母鼠始终在正常空气环境中饲养。

（5）我的窍门或者心得体会：OIR（氧诱导视网膜病变）小鼠模型是目前最常用的氧诱导视网膜病变模型。该动物模型不受动物性别的影响. 左右眼血管化区域和新生血管的严重程度具有较好的一致性. 避免了实验误差。建议采用75%O2浓度建立模型. 效果良好。

虽然有资料表明. 将小鼠持续5 d置于80%以上O2浓度的密闭氧箱内. 然后返回正常空气环境. 同样可以建立血管增殖性视网膜病变模型. 但在预实验中我们发现. 随着氧浓度的升高. 视网膜新生血管的发生率仅有轻微增加. 但母鼠的死亡率却明显增加。

另外在预实验中. 为了简化实验流程. 同时减少母鼠调换后母鼠食小鼠的现象. 我们曾试图将母鼠连续5 d置于75%O2浓度环境中饲养. 但发现母鼠多在第4～5 d或者出箱后因氧中毒肺水肿死亡。为此我们采用75%O2浓度. 每2 d对调母鼠同时更换水. 垫料. 食物. 这样基本可避免母鼠死亡. 同时获得基本一致的视网膜血管增生反应。

经验四 1）实验技术大类：

动物建模

（2）具体实验技术名称：

早产儿视网膜病变动物模型建立

（3）实验对象：

C57BL/6J小鼠

（4）模型制作：高氧组幼鼠与哺乳母鼠一起置于密闭容器内. 氧气的流量控制在0. 5～1. 0 L/ Min. 使容器内氧气分压控制在75%±2%. 期间用测氧仪持续监测容器内的氧分压；每2 d打开氧箱更换垫料. 加食. 换水. 替换母鼠。在此高氧环境中饲养5 d. 5 d后即出生第12 d (P12) 返回正常空气环境中继续与母乳共同饲养。对照组幼鼠与哺乳母鼠始终在正常空气环境中饲养。

（5）我的窍门或者心得体会：OIR（氧诱导视网膜病变）小鼠模型是目前最常用的氧诱导视网膜病变模型。该动物模型不受动物性别的影响. 左右眼血管化区域和新生血管的严重程度具有较好的一致性. 避免了实验误差。建议采用75%O2浓度建立模型. 效果良好。

虽然有资料表明. 将小鼠持续5 d置于80%以上O2浓度的密闭氧箱内. 然后返回正常空气环境. 同样可以建立血管增殖性视网膜病变模型. 但在预实验中我们发现. 随着氧浓度的升高. 视网膜新生血管的发生率仅有轻微增加. 但母鼠的死亡率却明显增加。

另外在预实验中. 为了简化实验流程. 同时减少母鼠调换后母鼠食小鼠的现象. 我们曾试图将母鼠连续5 d置于75%O2浓度环境中饲养. 但发现母鼠多在第4～5 d或者出箱后因氧中毒肺水肿死亡。为此我们采用75%O2浓度. 每2 d对调母鼠同时更换水. 垫料. 食物. 这样基本可避免母鼠死亡. 同时获得基本一致的视网膜血管增生反应。

经验五

1）实验技术大类：

形态学

（2）具体实验技术名称：

视网膜铺片ADP酶染色

（3）实验对象：

C57BL/6J小鼠视网膜

（4）简要步骤：

①在解剖显微镜下沿角巩膜缘切开眼球. 娩出晶状体. 液态玻璃体自行流出. PBS清洗后段眼杯。

②将眼杯倒扣于平皿上. 以视神经为中心. 小心剥离视网膜与脉络膜。

③以后极为中心. 将视网膜放射状切开为6瓣。

④将取出的视网膜置于24孔板中染色。

（5）我的窍门或者心得体会：视网膜铺片ADP酶染色法并不是一个复杂的技术. 对大鼠来说很容易. 但对于C57BL/6J小鼠和昆明小鼠来说则很难. 尤其是出生几天的幼鼠. 因此需要掌握一定的方法. 注意一些操作中的细节. 才能较完整的分离出视网膜. 使铺开的视网膜平整. 染色后背景干净. 血管分布层次清晰. 动静脉易于辨认。

1固定时间 关于眼球的固定时间. 我认为多聚甲醛固定4～6小时为宜。固定时间过短（﹤4小时）及固定时间过长（过夜）都不利于视网膜的分离。视网膜会与巩膜粘连在一起. 分离时容易扯破. 且铺片时容易卷曲。

2 眼杯的分割 有资料介绍说. 以视盘为中心. 用眼科剪将眼杯剪为4～6瓣. 但我在操作过程中发现. 眼科剪刃较厚. 剪开视网膜时很容易由于挤压力使视网膜变形. 甚至破裂。有的资料虽然说到要以视盘为中心将视网膜放射状切开. 但没有具体描述其过程。

我的做法是：分离出视网膜后. 用有齿弯镊抵住视网膜后部. 使其呈半竖立位. 用手术刀片（或刮胡刀片）以视盘为中心放射状切开视网膜. 切完一刀然后慢慢转动一下视网膜. 直至切成4～6瓣。切开时可以距离视盘近些. 以减小各瓣之间的相互拉力. 同时可以防止各瓣内的毛细血管网在铺片过程中随其弧度而卷曲起来。或者以视盘为中心. 间隔等距离呈V字型切除一些视网膜组织. 同样可以达到较好的效果。

3 铺片 染色后将视网膜夹持到载玻片上. 如果卷曲重叠. 可以用注射器针头轻轻将各瓣挑起. 铺平. 同时挑除各瓣页上漂浮的毛细血管网. 然后用滤纸沿视网膜边缘吸干残留的液体. 就可以用甘油树胶封片拍照了。

经验六

形态学方法

免疫组织化学

实验对象：石蜡切片

步骤：

①石蜡切片脱蜡和水化后. 用PBS冲洗3次. 每次5 Min。

②组织抗原修复. 修复完自然放置至室温。

③每张切片加1滴或50 μl过氧化酶阻断剂 (试剂A). 室温下孵育10 Min.

以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次. 每次5 Min。

④除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl正常非免疫动物血清 (试剂. 室温下孵育10 Min。

⑤每张切片加1滴或50 μl 0. 1%的Triton X-100破膜. 室温下孵育10 Min。

⑥除去血清. 每张切片加1滴或50 μl的一抗体 (稀释浓度为1：100). 4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次. 每次5 Min。

⑦除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl生物素标记的第二抗体 (试剂C). 室温下孵育10 Min。PBS冲洗3次. 每次5 Min。

⑧除去PBS液. 每张切片加1滴或50 μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液 (试剂D). 室温下孵育10 Min。PBS冲洗3次. 每次5 Min。

⑨除去PBS液. 用PBST溶液漂洗切片3次. 每次10 Min。

⑩除去PBS液. 每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB溶液. 显微镜下观察1～3 Min。

自来水冲洗. 苏木素复染. PBS或自来水冲洗返蓝。

梯度酒精脱水干燥. 二甲苯透明。

中性树胶封固。

数码相机拍照保存。

5）我的窍门或者心得体会：以上我写的是常规的免疫组化的步骤. 但其实我试过在苏木素复燃. 氨水返蓝后不用再繁琐的进行梯度酒精脱水以及二甲苯透明的这些步骤. 直接将玻片放在晾片板上自然晾干即可封片拍照观察. 而且效果也很好. 因为梯度酒精的作用就是脱水. 跟你自然晾干作用一样；中性树胶里面本身就有二甲苯. 因为在某种程度上可以起到透明的作用。这样一来. 整个免疫组化每次就可以节省一个小时的时间了。大家可以试试看。

经验七

形态学方法

载玻片处理（免疫组化用）

实验对象：载玻片

（一）我们大学多个实验室用的载玻片处理方法：

1. 普通的载玻片（例如： 帆船牌）. 将其排列在玻片架上. 置于热水中. 加洗衣粉. 煮沸30分钟

2. 倾去洗衣粉水. 自来水冲洗2遍. 把洗衣粉冲干净

3. 超声清洗（65 w. 10 Min）

4. 酸缸内浸泡过夜

5. 自酸缸内取出. 自来水冲洗

6. 超声清洗（65 w. 10 Min）

7. 双蒸水冲洗. 烘干

8. 75%酒精浸泡过夜

9. 双蒸水冲洗. 烘干

10. 过明胶（3次）

（二）我改良的载玻片处理方法：

1. 购买洁净度高的载玻片（例如：世泰）

2. 置架排列后. 75%酒精中浸泡过夜

3. 取出后. 双蒸水洗涤. 烘干

4. 过明胶（3次）

我的窍门或心得体会：

1. 经改良后的步骤简单快捷. 节省大量时间。旧方法最起码要4天时间. 新方法2天就完成了。当处理少量载玻片可能不觉得有多大差异. 但如果你主要研究形态学的话. 处理几百张载玻片的时候. 就可以体验到这两种方法的差别。

2. 很多人用多聚赖氨酸处理载玻片. 个人觉得还是明胶可靠. 很少掉片. 比较过自己用多聚赖氨酸处理的载玻片或者是直接从公司购买的多聚赖氨酸处理的载玻片. 都有不同程度的掉片现象. 做石蜡切片的可能相对还好一些. 但是冰冻切片. 个人感觉明胶处理的的载玻片明显优于多聚赖氨酸处理的载玻片。并且. 明胶经济实惠. 非常便宜. 而多聚赖氨酸很贵；过明胶可以用个大烧杯批量处理. 过多聚赖氨酸的时候那可是细活。

经验八

（1）实验技术大类：

动物模型建立

（2）具体实验技术名称：

经侧脑室注射给药方法

（3）实验对象：

大鼠

（4）简要步骤

1) 手术器械高温消毒. 立体定位仪经碘酊擦拭后酒精脱碘。

2) 大鼠先经10％水合氯醛按3. 5 Ml?B w的剂量腹腔注射麻醉. 待麻醉后颅顶部备皮。

3) 大鼠头部按颅骨水平位 (即调整门齿杆. 使前囟与人字点相平) 被固定在立体定位仪上. 常规消毒. 剪开颅顶皮肤. 暴露颅骨的前囟. 3%的双氧水擦除骨膜. 拭去血迹。

4) 参考 geor ge Paxinos & C harles watson所著的大鼠脑立体定位图谱 (T he rat brain in stereotaxic coordinates. 3rd edition)所示. 选取前囟后0. 8 M M (AP：0. 8 M M). 左侧旁开1. 5 M M (L: 1. 5 M M) 位点为左侧脑室注射点. 用电钻在颅骨该位点钻孔备用。

5) 将5 μl微量进样器抽吸好各组所需注射试剂 (1. 5 μL) 后. 固定于立体定位仪垂直臂杆上. 以颅骨平面为参考平面. 旋转臂杆使针头经颅骨表面的侧脑室注射点钻孔处进针至颅骨平面下4. 3 M M深度 (AP: -0. 8 M M. L: 1. 5 M M. V: -4. 3 M M) 后固定。

6) 缓慢旋转微量进样器尾端旋钮. 使1. 5μL注射液缓慢注入. 注射时间5 Min. 以尽量减轻人为因素所致损伤. 同时观察大鼠呼吸. 心率等生命体征。注射后留置针头5 Min. 使注射液尽量全部被吸收以避免随针头带出。旋转立体定位仪垂直杆缓慢退针. 退出颅骨平面后. 取下微量进样器。

7) 解除耳杆. 牙套等固定装置. 将大鼠单独置于鼠笼中等待麻醉苏醒。

（5）我的窍门或者心得体会

暴露前囟的时候使用3%双氧水擦除颅骨骨膜. 骨缝处的结缔组织经双氧水的作用后会显示出清晰的"十"字交叉. 交叉点即为前囟. 定位准确；另外. 双氧水擦除骨膜还可以起到止血的作用。

经验九

（一）实验技术大类：

形态学方法

（二）具体实验技术名称：

Neo-Ti M M染色

（三）实验对象：

大鼠脑组织冰冻切片

（四）简要实验步骤

1. 大鼠灌注取脑. 对半切开. 左侧大脑半球用于Neo-Ti M M染色. 右侧大脑半球用于免疫组化染色。

2. 取左侧脑半球. 先置于1%硫化钠 (Na2S) 溶液浸泡30 Min. 转置于3%戊二醛/4%多聚甲醛/0. 1 Mol/L PB溶液中固定48 h。

3. 转置20％. 30％蔗糖/0. 1 Mol/L PB溶液梯度脱水. 直至标本在标本瓶中沉底后取出. 滤纸吸干表面水分。

4. 标本经OCT包埋剂包埋. 连续冠状位切片. 层厚45 μ M。每隔4张取1张. 留取3个切片平面. 用于Neo-Ti M M染色。

5. 37 ℃烤箱风干1 h. 置于阴凉处自然风干过夜. 4 ℃冰箱内储存备用。

6. Neo-Ti M M 染色方法：

(1) 制备显色剂：

① 50%阿拉伯胶60 Ml

② 柠檬酸缓冲液10 Ml (含2. 55 g柠檬酸和2. 35 g柠檬酸钠的)

③ 5. 67%对苯二酚溶液30 Ml (含对苯二酚1. 7 g)

④ 17%硝酸银0. 5 Ml (含硝酸银0. 085 g)

染色前于暗室内将①. ②. ③三液充分混匀. 再加入④充分混匀. 即配即用。

(2) 恒温避光染色：置于恒温37 ℃摇床中避光染色120 Min。

(3) 充分水洗：流水冲洗至少30 Min。

(4) 梯度脱水：70%. 80%. 95%酒精各脱水3 Min. 100%酒精 ( I ). (II) 各脱水5 Min。

(5) 透明：二甲苯 ( I ). 二甲苯 (II) 各透明5 Min。

封片： 中性树胶封片保存。

我的窍门或者心得体会:

Neo-Ti M M染色传统方法要硫化钠 (Na2S)经心脏灌注. 但是如果要你要利用脑组织标本检测多个指标. 不能灌注硫化钠的话. 可以生理盐水灌注后取脑. 对半切开. 左右脑作不同的处理。取出的脑标本再浸泡硫化钠. 同样可以做出满意的Neo-Ti M M染色效果。另一半脑组织可以做其他处理。

经验十

（一）实验技术大类：

细胞培养. 免疫组化

（二）具体实验技术名称：

细胞爬片. 固定. 免疫组化

（三）实验对象：

细胞

（四）简要步骤

细胞爬片一般的过程是：在孔板中放一块大小合适切无菌的玻片. 然后把消化均匀的悬浊液吸入孔板中覆盖玻片. 然后放入培养箱培养. 第二天观察细胞状况. 如果爬片良好. 单层状. 那么就可以吸取培养液. PBS冲洗后. 用多聚甲醛固定. 然后将固定的玻片拿出. 进行后续的细胞免疫组化。

（五）我的窍门或者心得体会

我改良的方法：直接用那种独立的一次性的塑料培养皿. 大小大概相当于一个24孔板的孔. 然后按照上面的方法. 把消化均匀的悬浊液吸入培养皿中. 不过培养皿中不用再放玻片了. 然后放入培养箱培养. 第二天观察细胞状况. 如果爬片良好.

单层状. 那么就可以吸取培养液. PBS冲洗后. 用多聚甲醛固定. 然后固定好之后. 用一个圆锥似的尖的利器在培养皿的底壁上画一个大小适当的圆. 要用力一点. 使得这个圆的边缘形成一个小沟. 这样一来. 在后续的细胞免疫组化过程中. 你要的各种液体. 包括抗体之类的. 都可以以这个圆为目标. 因为有小沟的存在. 所加的液体不会到处流. 节省了抗体和试剂. 等做完免疫组化时. 也同样是不用进行酒精和二甲苯透明. 直接晾干. 然后放在显微镜下直接观察和拍照。

另外如果经费允许的话. 可以直接买那种用来做共聚焦的一次性独立的塑料培养皿. 这种培养皿的底壁上已经设计了现成的一个圆形的小沟. 不用你再自己画一个小沟了. 而且特别干净。只是价格比较贵。

经验十一

（一）实验技术大类：

分子生物学

（二）具体实验技术名称：

微小组织的RNA提取技巧

（三）实验对象：

视网膜等微小组织

（四）简要步骤

对于大块的组织提RNA常规的就是用玻璃的匀浆器冰上操作. 但对于微量的组织. 比如说刚出生的小鼠的视网膜如何提取RNA呢？其中最关键的步骤是怎么找一种合适的仪器. 用什么合适的方法才能够提取出RNA呢？毕竟视网膜非常小. 只有大概一滴胶水那么大小. 即使用最普通的玻璃匀浆器. 也显得非常大. 视网膜都会粘在容器壁上. 最后视网膜都没了。

（五）我的窍门或者心得体会

首先我用的容器是1. 5毫升的无菌EP管. 一个可以放下1. 5毫升的无菌EP管的冰盒. 还有最重要的一个器具-- handy Pestle微量匀浆器. 日本TOYOBO公司. 货号是： h MX-301. 这种器具最大的特点就是. 它的头端是一个分叉的结构. 有四个叉. 这样一来. 当你用它来挤压放在EP管中的视网膜组织时. 由于EP管的底部是圆锥形的. 那么由于挤压的原因. 器具头端的四个分叉就会被撑起来.

正好牢牢地把组织卡在EP管的底部. 这样一来. 你就可以用力进行匀浆了. 不过要把EP管插在冰盒的空里面匀浆. 在加入TRIZOL . 由于EP管只有1. 5毫升的体积. 第一次先加大概1. 5毫升的TRIZOL. 然后用力匀浆. 匀浆的差不多了. 再加入0. 5毫升的TRIZOL. 直至匀浆到无明显可见的大颗粒物位置。不要一下子加1毫升TRIZOL. 那样等你用力匀浆时很容易溢出来. 而且液体太多. 组织不容易固定. 会在TRIZOL中飘来飘去。

经验十二

1）实验技术大类：

动物建模

（2）具体实验技术名称：

早产儿视网膜病变动物模型建立中如何防止母鼠对调后食小鼠的问题

（3）实验对象：

C57BL/6J哺乳母鼠与小鼠

4）模型制作：我在上面已经写过了ROP模型如何建立了。在这个模型中. 由于小鼠要在密闭的高氧箱里待5天才能出来. 而小鼠又为断乳. 因此母乳也必须和小鼠一块被放进高氧箱里. 但问题是. 小鼠可以耐受5天的高氧. 而母鼠则不能. 一般3天之后就会因为肺水肿死亡. 因此就必须每两天把空气组和高氧组的母鼠进行调换. 来哺乳对方的鼠仔。这样就可以避免母鼠连续在高氧箱中待5天而死亡. 但问题又来了. 当你对调过母鼠后. 由于老鼠是靠气味来判断自己的鼠仔的. 母鼠会把对方的鼠仔咬死. 如何防止对调后母鼠食小鼠呢？

（五）我的窍门或者心得体会

首先把各笼中的母鼠拿出来. 立即做好标记. 以免待会搞错了. 高氧组母鼠还是空气组母鼠。然后把高氧组的鼠仔和空气组的鼠仔进行对调. 对调后用对方笼子中的垫料. 最后是混有粪便的垫料去擦小鼠的身体. 尽可能的让小鼠身上染上对方笼子中的气味. 也就是对方母鼠的气味.

过二十分钟左右再按照对应关系把母鼠放入相应的笼中. 然后在旁边观察一会. 看看母鼠是否咬对调后的对方的鼠仔. 我观察的结果是. 没有发现咬的. 只要气味足够大. 母鼠就分辨不出来. 就会当做自己的鼠仔进行哺乳。

另外可以在笼子中加一些瓜子. 花生之类的零食. 有催奶的作用. 而且母鼠营养好了. 也就不会乱咬小鼠了。