Southern 杂交操作步骤及注意事项

　Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

　　一、基因组DNA的限制酶切

　　根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。

　　具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入

　　DNA（1μg /μl） 20 μg

　　10×酶切buffer 4.0 μl

　　限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl

　　加ddH2O 至 500 μl

　　在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。

　　消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。

　　如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。

　　二、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳

　　琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。

　　表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围

　　1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。

　　2. 电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。

　　三、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物

　　转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。

　　1. 试剂准备

　　① 变性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。

　　② 中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl；

　　③ 转移液（20×SSC）： NaCl 175.3g；柠檬酸三钠82.2g，NaOH 调pH 至7.0，加ddH2O至1000ml。

　　2. 操作步骤

　　① 碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。

　　② 中和:将凝胶转移到中和液15min。

　　③ 转移 按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。（ 转移过程一般需要8-24hr，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。）

　　④ 转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80°C烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。

　　四、探针标记

　　进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。

　　探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。

　　以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：

　　1. 取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。

　　2. 在另一个0.5ml离心管中加入：

　　Labeling 5×buffer （含有随机引物） 10μl

　　dNTPmix (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM) 2μl

　　BSA（小牛血清白蛋白） 2μl

　　[a-32P]dATP 3μl

　　Klenow酶 5U

　　3. 将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混匀。室温或37℃ 1hr。

　　4. 加50μl 终止缓冲液终止反应。

　　标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/μl