总DNA质量检测及酶切

实验步骤：

1．取 10μl DNA 于 0.8% 凝胶检测；

2．将 DNA 调节浓度至 300-400 ng/μl；

3．仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书，熟悉反应条件及酶切的贮存浓度（ 10U-50U/μl ）厂家配套试剂；

4．计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量：（ 0.5 ml tube 中）

DNA(3-5μg) 10μl

10 × buffer reaction 1.5μl

Enzyme (15 U/μl) 0.8μl （冰上）

ddH2O 2.7μl

混匀，短暂离心；

5．37 ℃ 温浴 1-2 hrs ( 纯 DNA) 或 10 hrs （粗制 DNA ）；

6．加入上样缓冲液终止酶切反应，也可 65 ℃加热 10 min 使酶变性失活；

7．电泳检测酶切效率：

每个样品取 1/10 量用琼脂糖电泳检测，制胶及点样方法同上。

结果分析：

若水稻 DNA 呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则需重做；

DNA 被切烂： DNA 降解，重新提 DNA ；

DNA 切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化；

若是 BAC 克隆 DNA ，酶切后应出现多条很清晰的不同大小 DNA 带。

思考：

1.什么是酶星活性？如何避免？

2.影响酶切效率的因素？

3.EB 指示剂原理？