Southern 转印分析

在胶体中的DNA 可利用毛细现象的作用将DNA 牵引转印至覆盖在胶片上的滤膜，经烘烤或UV 照射后，可使DNA 固定在膜上，以进行探针的杂合（hybridization） 反应。

仪器用具：

玻璃缸；玻璃板或吸水海绵；Crosslinker （Stratalinker 1800, Stratagene）

药品试剂：

10×SSC （1.5 M NaCl; 0.15 M sodium citrate） 或20×SSC

变性溶液 （1.5 M NaCl; 0.5 N NaOH）

中和溶液 （1 M Tris-Cl; 1.5 M NaCl, pH 7.5）

Nylon membrane 尼龙膜

40 Methods in Biotechnology Vol 1

Whatman 3MM 滤纸

吸水纸

方法步骤：

1） 电泳的洋菜胶片，浸于0.25 N HCl 中15 min （当DNA 分子量不大时，可省去此步骤）；以无菌水润洗胶片后，将胶片置于变性溶液中，于室温缓慢震荡15 min,更换新的变性溶液后再处理15 min.

2） 以无菌水润洗胶片，再以中和溶液浸泡30 min,其间更换一次。

3） 戴手套将尼龙膜剪裁成胶体大小，在角落剪一缺口作记号。另裁剪数张较胶片稍小的3MM 滤纸。

4） 取一玻璃缸，加入10×SSC.将一块长形玻璃板架在缸上，裁剪一张长形3MM 滤纸，宽度须略大于胶片，将滤纸置于玻璃板上，使滤纸两端顺着玻璃板垂入缸内溶液中。加一些10×SSC 于滤纸上使其湿透，并赶掉滤纸与玻璃板间的气泡。

若有3~5 cm 厚的干净海绵，则可取代玻璃板。可将海绵置于缸中，加入10×SSC,但不可淹过海绵。海绵湿透后，其上放一张比胶片大的3MM 滤纸，要赶掉滤纸与海绵间的气泡。

5） 将处理过的胶片置于滤纸上，赶掉气泡，小心将尼龙膜盖在胶片上，不要有气泡产生。 再依序盖上两张以10×SSC 浸湿的滤纸及两张干的滤纸，并以保鲜膜将胶片四周封住。最后覆盖一迭吸水纸，上面放一块玻璃板或塑料板，以重物压住即可。在室温下静置过夜。

6） 转印后，小心移去重物、吸水纸、3MM 滤纸等，在尼龙膜相对于样品槽的位置作记号。将尼龙膜掀开，与胶片接触面朝上，置于10×SSC中缓慢震荡5 min,以洗去附着在膜上的洋菜胶。 转印后的胶片可再以EtBr 染色，视是否转印完全。

7） 将尼龙膜置于干净的滤纸上 （与胶片接触面朝上），移至UV crosslinker中，进行crosslinking 以将DNA 固定在膜上。

8） 干燥后的尼龙膜即可进行杂合。 若不立即进行杂合，可将尼龙膜夹于两张滤纸间，置于干燥箱中存放。