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DNA实验

Southern 转印分析

2024-09-29 DNA实验 加入收藏
在胶体中的DNA 可利用毛细现象的作用将DNA 牵引转印至覆盖在胶片上的滤膜,经烘烤或UV 照射后,可使DNA 固定在膜上,以进行探针的杂合(hybridiza

在胶体中的DNA 可利用毛细现象的作用将DNA 牵引转印至覆盖在胶片上的滤膜,经烘烤或UV 照射后,可使DNA 固定在膜上,以进行探针的杂合(hybridization) 反应。

仪器用具:

玻璃缸;玻璃板或吸水海绵;Crosslinker (Stratalinker 1800, Stratagene)

药品试剂:

10×SSC (1.5 M NaCl; 0.15 M sodium citrate) 或20×SSC

变性溶液 (1.5 M NaCl; 0.5 N NaOH)

中和溶液 (1 M Tris-Cl; 1.5 M NaCl, pH 7.5)

Nylon membrane 尼龙膜

40 Methods in Biotechnology Vol 1

Whatman 3MM 滤纸

吸水纸

方法步骤:

1) 电泳的洋菜胶片,浸于0.25 N HCl 中15 min (当DNA 分子量不大时,可省去此步骤);以无菌水润洗胶片后,将胶片置于变性溶液中,于室温缓慢震荡15 min,更换新的变性溶液后再处理15 min.

2) 以无菌水润洗胶片,再以中和溶液浸泡30 min,其间更换一次。

3) 戴手套将尼龙膜剪裁成胶体大小,在角落剪一缺口作记号。另裁剪数张较胶片稍小的3MM 滤纸。

4) 取一玻璃缸,加入10×SSC.将一块长形玻璃板架在缸上,裁剪一张长形3MM 滤纸,宽度须略大于胶片,将滤纸置于玻璃板上,使滤纸两端顺着玻璃板垂入缸内溶液中。加一些10×SSC 于滤纸上使其湿透,并赶掉滤纸与玻璃板间的气泡。

若有3~5 cm 厚的干净海绵,则可取代玻璃板。可将海绵置于缸中,加入10×SSC,但不可淹过海绵。海绵湿透后,其上放一张比胶片大的3MM 滤纸,要赶掉滤纸与海绵间的气泡。

5) 将处理过的胶片置于滤纸上,赶掉气泡,小心将尼龙膜盖在胶片上,不要有气泡产生。 再依序盖上两张以10×SSC 浸湿的滤纸及两张干的滤纸,并以保鲜膜将胶片四周封住。最后覆盖一迭吸水纸,上面放一块玻璃板或塑料板,以重物压住即可。在室温下静置过夜。

6) 转印后,小心移去重物、吸水纸、3MM 滤纸等,在尼龙膜相对于样品槽的位置作记号。将尼龙膜掀开,与胶片接触面朝上,置于10×SSC中缓慢震荡5 min,以洗去附着在膜上的洋菜胶。 转印后的胶片可再以EtBr 染色,视是否转印完全。

7) 将尼龙膜置于干净的滤纸上 (与胶片接触面朝上),移至UV crosslinker中,进行crosslinking 以将DNA 固定在膜上。

8) 干燥后的尼龙膜即可进行杂合。 若不立即进行杂合,可将尼龙膜夹于两张滤纸间,置于干燥箱中存放。


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