甲基化检测之亚硫酸氢盐修饰后测序法

第一部分 基因组DNA的提取

这一步完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：

1、蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2、RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20℃保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：

1、紫外分光光度计计算OD比值；

2、1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。第二种方法优于第一种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出，所用双蒸水（ddH2O）均经高压蒸汽灭菌。

1、将约2μgDNA于1.5mlEP管中使用ddH2O稀释至50μl；

2、加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

3、42℃水浴30min；以下步骤在水浴期间配制：

4、10mM 对苯二酚（氢醌），加30μl至上述水浴后混合液中（溶液变成淡黄色）；

5、3.6M 亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用ddH2O稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520μl至上述水浴后溶液中；

6、EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；

7、加200μl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；

8、50℃避光水浴16h。

这一步需要注意的细节：

1、基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4μg；

2、所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确；

3、亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收；

4、水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。