放射性同位素标记的DNA序列测定分析

测定DNA 的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA 测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA 聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA 核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA 模板或经变性的双链DNA 模板和一种恰当的DNA 合成引物。其基本原理是DNA 聚合酶利用单链的DNA 模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA 聚合酶利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA 链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA 的互补链序列。

一、 试剂准备

1. 硅化液：四氯化碳250ml，二氯二甲基硅烷25ml。

2.6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存于棕色瓶中。使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵（25%）50μl，TEMED 50μl，轻摇混匀，立即灌胶。

3.质粒DNA 碱变性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH4.8），无水乙醇，70%乙醇。

4.T7测序试剂盒。

二、操作步骤

1.  测序板硅化，流水、ddH2O洗，无水乙醇洗，晾干。

2.  灌胶：装好测序板，玻璃板以15-30°角度倾斜放置，用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间，将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘，深约0.5-1cm。夹好，将测序板放水平。聚合约3hr后预电泳。

3.  预电泳：按照说明要求安装好电泳装置，在上槽和下槽注入1×TBE。设置温度50℃，功率100W，时间约30min。

（同时准备测序反应）

4.  质粒DNA 双链碱变性：DNA 3-5μg溶于32μl ddH2O中，加2N NaOH 8μl，混匀，室温静置15min。加3M NaAc 7μl，无水乙醇120μl，混匀，-20℃放置30min。离心12000g× 15min，弃上清，70%乙醇500μl洗一次，离心12000g×7min。弃上清，晾干沉淀，10μl灭菌ddH2O溶解。

5.  模板与引物复性：加2μl测序引物、2μl Annealing buffer， 混匀，稍稍离心，65℃温育 5min，立即放置于37℃10min，室温5min以上。

6.  标记反应：加 3μl labeling mixture 、1μl相应放射性同位素（10μCi）、2μl T7测序酶（使用前以稀释液1∶5稀释），混匀，离心，置37℃5min。

7.  预先准备四个0.5ml微量离心管，标上A、C、G、T，分别在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。

8.  链终止反应：在A、C、G、T四个微量离心管中分别加入反应液4.5μl，37℃ 5min。加入stop solution 5μl，短暂离心。

9.  上样：关上预电泳电源，冲洗胶平面，将鲨鱼齿插入胶平面中约1-2mm形成加样孔。将四个反应管置80℃ 2min。立即取1.5-2μl加到加样孔上。

10．电泳: 50℃，100W，电泳2.5hr后，暂停电泳，在预留孔二次上样后，继续电泳2.5hr。

11．下胶：停止电泳，取下测序板，倒掉电泳缓冲液。拆开测序板，凝胶应粘在未硅化的的玻璃板上。裁一张比胶稍大一些的滤纸，平铺在胶上，掀起滤纸，凝胶就被一起掀起。

12．压片：将凝胶盖上保鲜膜，用monitor测读放射强度，以估计曝光时间。在暗室中覆上X光片，置暗夹中，-70℃放射自显影。

13．洗片、读片：取出暗夹，回到室温。经D72显影、酸性定影液定影，水洗，晾干。在X光片灯上读出序列。

三、注意事项

1. 测序板清洗、硅化的好坏直接影响灌胶及下胶。处理不好时容易导致灌胶时气泡的产生，下胶时则易使电泳胶损坏。

2. 灌胶时要避免胶的渗漏；注射器将凝胶灌到两块玻璃之间时，注意速度的控制，防止气泡的产生。

3. 测序反应及电泳上样时要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同时要加强整个后续实验过程中自身的防护。

4. 规范、妥善处理放射性同位素接触物品及废弃物。

手工测序需要使用同位素，这给操作带来许多不便，对操作者也有一定的损害。DNA 测序仪的出现解决了这一问题，它不使用同位素标记，自动化程度高，测序效果好。虽然DNA 测序仪的价格目前仍比较高，但每次测序的花费并不算高，而且商品化服务也令人满意。