关于全血的保存-DNA提取-pcr个人经验

做了好多DNA提取保存，吃了很多亏给大家点建议吧：（有疑问可以回帖，有时间我会回答如果我知道）。

　　血液保存：

　　EDTA抗凝最好，肝素也可以不过经常会影响后续试验，一般可以保存在-20和-80保存3-5年没有问题——保存时间越长似乎dna提取越少，再长时间我也没有试过，注意解冻一次大概损失20%左右（提取感觉估计得到的可能不准），放的时间长也会降解一些。4°做好不要太长3天我是试过没有问题再长不知道了。血凝块就算了吧太难了结果不稳定。如果要分离血浆请在把血冻起来之前，其实越早越好否则有时候会溶血就麻烦，对提取DNA没有影响，但是对提取血浆就问题大了。

　　DNA提取：

　　一般离心柱法提取比较纯，片段短一些，损失大一些，沉淀法提取出来要长一些，效率比较高，估计沉淀法提取出来的是离心柱发的2-3倍量（注意了沉淀法有时候杂质太多70%沉淀这一步可以多1-2次）也可以自己配试剂提取摸索一下，我没有试过，听说不是很难。

　　我用过的试剂盒评价：

　　（试剂盒最好问一下保存液的成分）其实多数国产公司提取都没有问题都好用。

　　1. 天根沉淀法和离心柱法——听说是QIAGEN的技术当然QIAGEN非常好就是太贵根本没有必要考虑有的政府部门钱多没有地方花采用它：方便、简单、比进口便宜，优点蛋白酶k可以放常温，有个致命缺点就是提取的DNA保存时间很短。运气不好似乎常温下2小时就开始降解，有时候在4°放一周就降解了，让人很烦，放-20反复解冻，几次之后也不行了。（我有一批烦放了2个月都挺好，有一批才第二天就做不出来跑胶结果降解-连上前边的降解500个左右气啊）我写信问过为什么了。他们回答是因为他们洗脱液（DNA保存液TB）成分里边的问题，保存te就会好，你要保存你可以自己配TE，怎么服务的，说明书上也不写出来，现在不敢用他们的了（还有他们的稍微贵一点，用便宜的好了），以前用的货号DP-318。

　　2. 康为世纪的离心柱和沉淀法：方便、简单、比天根的更便宜，DNA保存的时间似乎比天根的长，似乎4°一个月没有问题，再长没有试过（等试试再来补充因为现在才改用他们的），我认为洗脱液（DNA溶解液）似乎和天根不同，含有EDTA呵呵tris吧，4°1个月没有问题我放过50多个样本，我估计1年没有问题，缺点蛋白酶k只能放-20要注意保存好

　　3. DNA 抽提 Puregene 试剂盒（美国 Gentra 公）：是用沉淀法、方便简单，保存试剂时间长，DNA放在溶解液里边4°2年都没有问题，就是有点贵，非常好用。后边有个网友用了宝生物公司的DNA提取试剂盒也很好用，也很简单，我自已倒是没有用过，注意他的保存液体中有没有EDTA。

　　总结：推荐后两个吧其他试剂盒没有用过，沉淀法300ul血可以做100次pcr，25ul体系，离心柱发法600ul血。

　　补充：解冻血稍微快一点好，例如37°解冻用蛋白酶k比试剂盒说明延长一点比较好。

　　提取好以后保存:比血液更保存的久，5年没有问题，不过估计天根可能会有问题，因为他的TB成分有问题，温度来说4°、-20°、-80°都可以但是-80°是最好了，不过4°冻融会损失DNA。

　　从成分上来说：

　　双蒸水不好很容易降解特别在4°，ph8.0的水（加氢氧化钠）：稍微好一点，在4°搞不好就一周降解，加点EDTA会好很多-EDTA我感觉2mmol就可以了最好每微升不要超过5mmmol-太多影响pcr，TE不错可以放很长时间在4°至少一个月，一般te里边就1mmolEDTA，也可以加到2，有时候可以保存1年没有问题，用试剂盒看厂家提供的配方了，一般和这几个差不多，又怕EDTA影响实验又担心不好保存可以用没有加EDTA的TE。

　　检测：可以测od值你搜索一下就知道了做点pcr一般影响不大-太差说明乙醇沉淀多做一次就好了，其实最好跑胶吧0.8-1的琼脂糖，7v/cm的电压跑15分钟，看到一个跑得很慢的估计离孔21cm左右吧，大约100-20kb。浓度走个mark比一下亮度就可以了（4ul上样）。

　　产率：人血100ul有3-6ug吧经验估计看你保存的和样本来源了。

　　ps1：提取基因组时候同时线粒体DNA也被提取了，我试过。

　　ps2：pcr美微升10ng运气好就可以跑出来了，只要你电泳4ul上样可以看得到条带基本都可以做25ulpcr加1-6ulDNA

　　当pcr不稳地的时候可以多加点DNA尝尝有帮助。

　　ps3：提取组织中的DNA可以用trizol，顺便也提取RNA，只提取的话用自己去查。

　　ps4：一般来说沉淀法300ul血加溶解液100ul，离心柱发500ul加100溶解液。

　　Ps5：提取血中RNA可以先提取淋巴细胞在，然后再从淋巴细胞里边提取RNA-按一般的trizol方法即可，直接用血和trizol效果不好-我做的时候是这样的。

　　ps6：离心柱法提取血的试剂盒来提取组织，呵呵省的买专门提取组织的了省点钱！！！称量小于50-20mg的组织（20一般够了）与EP管中，(括号内的可以省略，加了之后效果好产率高不少：打碎处理为细胞悬液，然后10,000rpm(～11,200×g)离心1 min，倒尽上清，，也可以稍微剪成小块这样倒是不复杂)加入200ul GS缓冲液，加入20-40ul 蛋白酶 K 溶液，加 150ul 缓冲液GB，充分颠倒混匀。56℃放置 4-7h左右4小时一般够了，每个小时颠倒一次最好。后边的步奏不说了要么是沉淀，要么过离型柱哈哈把提取血的来提组织省了钱啊！