碱变性法提取质粒DNA
【基本原理】
普遍采用的碱变性法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理是，利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在碱变性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
分离质粒DNA的方法一般包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
【器材】
1．1.5ml Eppendorf 管
2．微量加样器
3．培养皿
4．台式高速离心机
5．高压灭菌锅
【试剂】
所有的试剂均需高压灭菌（有机溶剂除外）
1 ．溶液 I | 50mmol /L 葡萄糖 |
25mmol/L Tris -Cl （ pH8.0 ） | |
10mmol/L EDTA （ pH8.0 ） | |
2 ．溶液 II | 0.2mol/L NaOH |
1%SDS | |
临用前配制 | |
3 ．溶液 III | 5mol/L 乙酸钾 60ml |
3mol/L 冰乙酸 11.5ml | |
ddH 2 O 28.5ml | |
pH 5.2 | |
4 ． RNase A ： | 10mg/ml |
5 ． TE 缓冲液： | 1mmol/L EDTA in 10mmol/L Tris-Cl （ pH8.0 ） |
6 ． Tris-Cl （ pH8.0 ）饱和苯酚 | |
7 ．氯仿 / 异戊醇（ v/v ）： | 24/1 |
8 ． 70% ：乙醇 | |
9 ． LB/Amp ： | LB/ 氨苄青霉素（ 50 μ g/ml ） |
【操作步骤】
1．从选择性培养平板上取出一个菌落，移至含有2ml LB/Amp培养基的试管中。在37℃条件下振荡培养12-16h。
2．将1.5ml培养物移至1.5 ml Eppendorf管中，4000 rpm离心8min。
3．弃上清，将细菌沉淀悬浮在100μl预冷的溶液I中，并加入2.5μl RNase A（10mg/ml）。
4．加200μl新配制的溶液II, 盖紧管口。快速颠倒离心管5次使内容物混合、放置冰上5min。
5．加150μl预冷的溶液III，盖紧管口。将管颠倒5-8次，冰上放置20min。
6．离心（1000rpm，4℃，5min），将上清转移到另一离心管中。
7．加等体积苯/氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心同上。
8．将水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇混匀后置冰上20min。
9．10 000rpm 4℃离心10min。
10．弃上清，加入0.5ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀，离心弃上清，在空气中使质粒DNA干燥10min。
11．将质粒DNA溶于20μl，ddH2O中，4℃保存。
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