Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > DNA实验

DNA实验

石蜡包埋组织的DNA提取及其应用

2024-10-12 DNA实验 加入收藏
近10年来,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域,为了解病理状态下基因组DNA 的变化积累了新资料。目前认为,人类基因组并非人们想像的那样稳

近10年来,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域,为了解病理状态下基因组DNA 的变化积累了新资料。目前认为,人类基因组并非人们想像的那样稳定,诸如基因重排、扩增、缺失,突变和DNA 甲基化类型改变等时有发生,这些改变对于基因表达和调控,以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。

医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织,是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法,是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA 或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。

这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术,本节 不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等(1986)成功地从蜡块中提取出高质量的DNA ,完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要,结束了DNA 研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史。

而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究,对肿瘤发生的分子机制的探讨,诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织DNA 提取的方法学及其潜在的应用前景。

一、石蜡包埋组织DNA 提取的基本方法

从石蜡包埋组织中提取DNA 的基本步骤,是在常规DNA 提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等(1985)最先提出的石蜡包埋组织DNA 提取技术(表1),是用机械的方法破碎组织,切除多余的石蜡,直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K(1mg/ml)的提取缓冲液加温孵育,然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA 虽不完整,但可被限制性内切酶切割,因而适于点杂交,印迹杂交等多种分子生物学实验。

Dubeau等(1986)在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡,保证了组织的完全破碎,使细胞与消化液充分接触,使DNA 释放和蛋白去除更加完全;其次通过两步消化的方法。

将不适于做分子杂交的降解的DNA 小片段去除,仅保留那些可螺旋化的完整的DNA 大分子,从而提高了DNA 质量,适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等(1990)对上述两种方法进行了比较,发现两种方法所取得DNA 之点杂交结果一致,非螺旋化DNA 亦不影响杂交分析。

表1 Gpelz氏DNA 提取方法的主要步骤

1.切除多余石蜡,暴露组织
2.将组织切碎(最大径<0.5mm),称重;
3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml,50~500mg/10ml),高速混悬2~3min;于48℃ 放置24h,其制备见表18-6;
4.再次混悬组织,加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%,孵育40h;
5.用等体积酚-氯仿溶液抽提3次;
6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA
7.-70℃放置2~4h
8.9000×g离心1h
9.沉淀物用70%乙醇洗1次
10.干燥,TE(pH7.2)溶解。

表2 TE9 DNA 提取液的制备

500mmol/LTris
20mmol/LEDTA
10mmoo/LNaCl
1%SDS
500μg/ml蛋白酶K

PH8.0

5μm组织切片

常规脱蜡、水化

第一次溶液A孵育(去上清)

第二次溶液A孵育(留上清)

氯仿-异戊醇抽提

RNA酶和蛋白酶消化

酚抽提

沉淀

(却除未螺旋化DNA )

透析

溶液A

2×SSC
100μg 蛋白酶K/ml
1% SDS


文章底部广告位

文章评论

加载中~