RNA提取及注意事项

目的

　　研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低经常影响RT-PCR、cDNA库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

　　主要试剂

　　Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

　　1. Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注重操作。

　　2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。

　　3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。

　　4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特别结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。

　　2-8℃ 避光保存一年。

　　预备工作

　　RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。

　　1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套

　　2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。

　　3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理

　　（1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。

　　处理的步骤如下：

　　O在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）

　　O将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。

　　O 将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC -H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。

　　O 灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。

　　（2）玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。