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RNA实验

RNA的琼脂糖凝胶电泳实验

2024-06-20 RNA实验 加入收藏
原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%~1.4%的凝胶,不同的RNA条带也能分开,但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下,R


原理

RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%~1.4%的凝胶,不同的RNA条带也能分开,但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。

材料与仪器

RNA样品溶液
琼脂糖 TAE电泳缓冲液 溴化乙锭 载样缓冲液 MOPS缓冲液
电泳仪 电泳槽 电子天平 移液器 枪头 微波炉 紫外透射检测仪 封口膜

步骤

一、实验材料、器具及药品
 
蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等。 琼脂糖,1XTAE电泳缓冲液,0.5 ug/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。
 
二、实验步骤
 
1.  用1xTAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶,加1xTAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
 
2.  在超净工作台上,用移液器吸取总RNA样品4 ul于封口膜上。在实验台上再加入5 ul 1xTAE电泳缓冲液及1 ul 的10X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。
 
3.  打开电源开关,调节电压至100 V,使RNA由负极向正极电泳,约30min后将凝胶放入EB染液中染色5 min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
 
三、  RNA的变性琼脂糖凝胶检测
 
1.  试剂
 
(1)MOPS缓冲液(1undefined):0.4 mol/L 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) (pH7.0),0.1 mol/L NaAc,10 mol/L EDTA。
 
(2)上样染料:50%甘油,1 mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝。
 
(3)甲醛。
 
(4)去离子甲酰胺。v电泳槽清洗:去污剂洗干净(一般浸泡过夜)水冲洗-乙醇干燥-3%H2O2灌满-室温放置10分钟-0.1%DEPC水冲洗。
 
2.  操作
 
(1) 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍,晾干备用。
 
(2) 配制琼脂糖凝胶。
 
①称取0.5 g琼脂糖,置干净的100 ml 锥形瓶中,加入40 ml蒸馏水,微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。
 
②待胶凉至60--70 ℃,依次向其中加入9 ml 甲醛、5 ml 10X MOPS缓冲液和0.5 ul 溴化乙锭,混合均匀。
 
③灌制琼脂糖凝胶。
 
(3) 样品准备:
 
①  取 DEPC处理过的500 ul小离心管,依次加入如下试剂: 10x MOPS缓冲液2 ul,甲醛3.5 ul,甲酰胺(去离子)10 ul,RNA 样品 4.5 ul,混匀。
 
②  将离心管置于60℃水浴中保10分钟,再置冰上2分钟。
 
③   向管中加入3 ul 上样染料,混匀。
 
(4)上样。
 
(5)电泳:电泳槽内加入1XMOPS缓冲液,于7.5 V/ml 的电压下电泳。
 
(6)电泳结束后,在紫外灯下检查结果。

注意事项

RNA琼脂糖凝胶电泳中务必去除RNASE酶的污染,所有的试剂需用DEPC水配制,所用的器材也要的DEPC处理并灭菌,防止RNA被降解。


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