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RNA实验

RNA足迹和修饰干扰分析实验

RNA
2024-06-14 RNA实验 加入收藏
原理RNA 足迹和修饰干扰分析(RNA footprinting and modification interference analysis)是用来研究 RN


原理

RNA 足迹和修饰干扰分析(RNA footprinting and modification interference analysis)是用来研究 RNA 与蛋白质相互作用的技术。RNA 测序及其结构分析的原理是 RNA 足迹试验的理论基础,它们都是建立在变性、半变性或自然条件下采用碱基特异性 的试剂来切割用放射性同位素标记了末端的 RNA 的方法之上。

材料与仪器

蛋白酶 K NTPαS 复合物
RNA 酶抑制剂 RNase T1 RNase V1 RNase T2 苯胺 柠檬酸 乙醇 硫酸铁铵 抗坏血酸钠 EDTA NaAc 硫脲 焦碳酸二乙酯 N-乙基-N-亚硝基脲 硫酸二甲酯 无水肼
硅烷化离心管

步骤

一、材料与设备

1. RNA 酶抑制剂 ( RNasin 等)。

2. RNase T1。

3. RNase B.cereus ( Bc )。

4. RNase V1。

5. RNase T2。

6. 蛋白酶 K。

7. 重蒸酚、酚:氯仿 ( 体积比为 1:1 ) 和氯仿。

8. 苯胺。

9. NTPαS 复合物(New England Nuclear-Dupont 公司)。

10. 0.5 ml 和 1.5 ml 的硅烷化离心管。

11. 0.1 mol/L 柠檬酸。

12. 乙醇。

13. 0.4 mol/L 硫酸铁铵(ammonium iron sulfate )。

14. 2 mol/L 抗坏血酸钠。

15. 0.8 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )。

16. Fe-EDTA。

17. 0.6% 的 H2O2(V/V)。

18. 0.3 mol/L NaAc(pH 3.8)。

19. 20 mmol/L 硫脲(thiourea )。

20. 焦碳酸二乙酯(DEPC )。

21. N-乙基-N-亚硝基脲(小心操作,强致癌性)。

22. 硫酸二甲酯 ( DMS )。

23. 3 mol/L NaAc(pH 4.5)。

24. 200 mmol/L NaBH4

25. 无水肼。

26. 纯净的双蒸苯胺,使用前在氮环境下重蒸并避光储存在 -20℃ 氮环境中。

27. 1-丁醇。

28. 1%(m/V)十二烷基硫酸钠(SDS )。

29. DEPC 处理 H2O:1 ml DEPC 加到 1 L 水中,剧烈振荡放置过夜,高压灭菌。

30. 10X RNA-蛋白结合缓冲液:依据分析的蛋白不同而不同,详见注意事项。

31. 小牛肝 tRNA:37°C 同 50 μg/ml 的蛋白酶 K 孵育 2 h,抽提,乙醇沉淀,重新溶解使终浓度 10 mg/ml。

32. 1.5X 凝胶上样缓冲液:10 mol/L 尿素,1.5X TBE,0.015% ( m/V)溴酚蓝,0.015% ( m/V ) 二甲苯青,1% SDS,过滤除菌并储存在 -20℃。

33. 10X 羟基缓冲液:50 mmol/L NaHCO3/Na2CO3(pH 9.2),1 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ),过滤除菌并储存于 -20°C。

34. 2X 抽提缓冲液:50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),300 mmol/L NaCl,0.05 % NP-40,10 μg/ml tRNA,1% SDS,过滤除菌并储存于 -20℃。

35. 2X 羟基终止/抽提缓冲液:50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),300 mmol/L NaCl,0.05% NP-40,10 μg/ml tRNA,1% SDS,20 mmol/L 硫脲,过滤除菌并储存于 -20℃。

36. 新饱和的 N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nimxsoure,ENU ) 溶液:将过量的 ENU (小心操作,强致癌性 ) 加入到 100 μl 乙醇中,离心除去未溶解的 ENU,上清用做碱基修饰试剂。

37. 10X ENU 修饰缓冲液:500 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0),10 mmol/L EDTA,过滤除菌并储存于 -20℃。

38. I2 储存液:用乙醇配制成 10 mmol/L。

39. 2X 硫酸二甲酯抽提缓冲液:50 mmoI/L Tris-HCl ( pH 7.4 ),300 mmol/L NaCl, 0.05% NP-40,10 μg/ml tRNA,1% SDS,125 mmol/L 巯基乙醇,过滤除菌并储存于 -20℃。

40. 肼/0.5 mmoI/L NaCl 和肼/3 mmol/L NaCl:将 NaCl 溶解在无水的肼中配制成合适的浓度。

二、操作方法

要成功的进行 RNA-蛋白相互作用的足迹和修饰分析试验,必须首先建立特异 RNA-蛋白相互作用的条件并了解它们的结合特点。核酸酶足迹通常能得到 RNA-蛋白复合物的低分辨率信息,核酸酶在较为广泛的条件包括在生理条件下都有明显的活性,而化学修饰试剂在某些情况下则要求更为严格的条件。然而核酸酶相对较大,其活性可能受到邻近碱基的影响,化学探针远远小于核酸酶,接近于溶剂大小,所以对 RNA-蛋白的相互作用能够提供更精细的信息,为了能全面的了解 RNA-蛋白质相互作用特点,最好的手段是首先釆用核酸酶定位相互作用的位点,然后釆用化学探针和修饰干扰分析来研究相互作用的方式。

进行修饰干扰研究,首先必须有一种可靠的方法从 RNA-蛋白结合反应液中分离 RNA-蛋白复合物,通常采用凝胶迁移分析、滤膜结合(filter bonding)和免疫共沉淀方法来分离 RNA-蛋白复合物,关键是不能破坏 RNA 与蛋白质之间的结合。本实验要求使用 经凝胶纯化后仅有一端被标记的 RNA。末端标记适合于小于 200 个核苷酸或者相互作用的区域在 200 个核苷酸之内的 RNA 分子,对于大于 200 个核苷酸或者是相互作用的区域在 200 个核苷酸以上的 RNA 分子,最好采用反转录酶进行引物延伸来鉴定切割位点。

1. RNA 酶足迹分析

RNA 酶足迹分析可以给出与蛋白质相互作用的 RNA 区段的低分辨率的图谱,在进行足迹反应以前,要确定核酸酶的浓度以便使大约 10 个 RNA 分子中只有一个被切割,这可以通过在 RNA-蛋白结合缓冲液中采用不同的酶浓度和不同的切割时间来实现。现在有一系列位点特异 RNA 酶可以用来进行 RNA 足迹,例如进行病毒相关的(VA ) RNA1 和双链的 RNA 依赖的蛋白激酶(PKR ) 的足迹试验,RNase T1 ( 0.00012 U/5 μl 反应体系),T2 ( 0.003 U/5 μl 反应体系)和 Bc ( 0.25 U/5 μl 反应体系)用来进行单链区的作图,RNase V1 ( 0.006 U/5 μl 反应体系)用来进行结构区的作图,RNase V1 可以识别 4 到 5 个或更长核苷酸形成的短的螺旋区,因此常被使用。大约 50~100000 计数/反应(用 Cerenkov 计数法测定)的 5' 或 3' 末端标记的 RNA 足够进行几个凝胶电泳和保持较短的放射自显影时间。



(1) 对于实验中所使用的每一种核酸酶进行如下反应:设置没有 RNase 的对照,对于每一种酶使用―系列的浓度,在有 MgCl(自然状态)或无 MgCl2(半变性状态)条件下进行实验,RNase V1 例外,因为该酶活性的发挥必须有 Mg2+ 的存在。

(2) 每一个反应加 1 μl 10X 结合缓冲液,1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA,末端标记的 RNA,1 μl 稀释的 RNase,加 DEPC-H2O 到终反应体积 5 μl,在 37℃ 孵育 15 min,然后加入 1 μl 10 mg/mg tRNA 和 10 μl 的 1.5X 凝胶点样缓冲液。

(3) 用 10X RNase T1 68℃(变性条件)消化 5 min,使每一个 G 都被切割,产生一个测序梯带。

(4) 采用强碱裂解产生以一个碱基递增的水解梯带:1 μl 10X 羟基缓冲液,1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA,末端标记的 RNA,加 DEPC-H2O 至终体积 10 μl,在 90℃ 孵育 2 min,加入 1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、10 μl 0.1 moI/L 的柠檬酸和 24 μl 1.5X 凝胶点样缓冲液终止反应。

(5) 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物,对于长的 RNA 可能需要进行几个不同浓度和不同时间的电泳。

(6) 标记的 RNA 可以直接采用放射自显影或者是磷屏检测。进行放射自显影时,将凝胶放在 X 射线片上,用塑料膜包裹,置于暗盒中于 -80°C 进行 X 射线片的放射自显影,如进行磷屏检测时,将凝胶放在 3 M 的 Whatman 纸上,用塑料膜包好,真空干燥,在室温条件下进行磷屏成像。

(7) 确定酶解的条件,使加入的 RNA 有 90%~95% 不会被切割,这有利于下一步的足迹实验。

(8) 在进行凝胶分析之前,应除去反应体系中的蛋白组分。用 DEPC-H2O 稀释反应液到 200 μl,加入 200 μl 的 2X 抽提缓冲液再次分离 RNA,加入等体积的酚:氯仿,振荡几分钟,混匀,用小塑离心机最高速度离心 10 min ( 约 16000 g ),收集上层水相。如前所述加入等体积的氯仿再次抽提,用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA,置干冰/乙醇中 10~20 min,4℃ 16000 g 离心 15 min,用预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀,用 5 μl 水与 10 μl 1.5X 点样缓冲液重新溶解沉淀。

(9) 没有蛋白的酶解反应液也要同时进行再次抽提和沉淀,为了便于分析,上样时应保持大致相同的量,包括作为对照的抽提后没用核酸酶消化的蛋白-RNA 复合物。



2. 采用对核糖骨架链特异的试剂进行足迹和干扰分析实验

除了化学探针相对较小能够给出相互作用位点更高的精确度以外,使用化学探针进行足迹分析和使用核酸酶进行足迹分析的原理相同。

(1) 羟基

羟基具有中性电荷,是用作化学足迹分析的最小物质,它半衰期短,通常采用序列不依赖的方式对核糖的 1' 或 4' 位进行切割,羟基对双链和单链的 RNA 具有相同的作用,但是核糖骨架链参与的高级结构对切割效率会有影响。这种切割反应比较温和,能够在 广泛的缓冲液、盐、温度和酸碱度条件下进行。与先前的试验一样,在进行 RNA-蛋白复合物的足迹实验以前需要在结合缓冲液中确定切割的条件。

① 准备过滤除菌的 0.4 mol/L 硫酸铁铵,2 mol/L 抗坏血酸钠,0.8 mmol/L EDTA pH 8.0,0.6% H2O2。将 0.4 mol/L 硫酸铵稀释至 0.4 mmol/L,然后同等体积的 0.8 mmol/L EDTA 混合,稀释 2 mol/L 抗坏血酸钠至 20 mmol/L,然后与等体积的 Fe-EDTA 混合物和等体积的 0.6% H2O2 混合。

② 首先在没有蛋白质的条件下消化 RNA 确定得到适当的切割梯带的条件,通过控制加入离子/EDTA/H2O2 混合物的量来调节切割的效率,对于 VA RNA1 最适的条件是等量的消化液加入到结合反应液中,室温下孵育 2 min。

③ 用 DEPC-H2O 稀释反应液至 200 μl,然后迅速加入等体积含有 20 mmol/L 硫脲 ( 羟基消除剂)的 2X 抽提缓冲液终止反应,采用1 “RNA 酶足迹分析” 中第 (8) 步的方法重新回收 RNA。

④ 建立了消化条件后,比较 RNA-蛋白复合物和未结合的 RNA 的切割情况,采用前面所述的方法分析所得到的结果。

(2) N-乙基-N-亚硝基脲

N-乙基-N-亚硝基脲(ENU ) 是一种温和的烷化试剂,能够使骨架链上的磷酸形成磷酸丙酯,这些修饰可以被温和的碱基试剂识别及切割,通过测定未结合的 RNA 来确定反应时间和使用的 ENU 量,建立合适的修饰条件,尽管这种修饰没有位点特异性,而且 RNA 主链参与的高级结构可能对反应产生影响,但是 ENU 能够用于足迹和修饰干扰分析试验。

① 加 2 μl 10X 结合缓冲液,1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA,末端标记的 RNA 或者 RNA-蛋白质复合物,5 μl 新鲜配制饱和 ENU,加水到 20 μl,37℃ 孵育 30 min。用水稀释至 200 μl,加入等体积的酚:氯仿,振荡几分钟混匀,用小型离心机在最高速度离心 10 min ( 约 16000 g ),收集上层水相,如前所述加入等体积的氯仿再次抽提,用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA,在干冰/乙醇里孵育 10~20 min,4℃ 16000 g 离心 15 min,用冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。同时用 5 μl 乙醇代替 ENU 作为空白对照。

② 重新溶解 RNA 沉淀于 200 μl pH 3.8 的 0.3 mol/L NaAc 中,然后加入 600 μl 乙醇,在干冰/乙醇里孵育 10~20 min,于 4℃ 16000 g 离心 15 min,用冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。

③ 新溶解 RNA 到 10 μl 的 100 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 9.0) 的溶液中,在 50℃ 孵育 5 min,乙醇沉淀 RNA 并进行变性凝胶电泳分析。

④ 如果要预先对 RNA 修饰进行干扰分析,在第 (1) 步中使用 10X ENU 修饰缓冲液并在 80℃ 孵育 2 min。

(3) 含有硫代磷酸酯的转录物

NTPαS 的 Sp 非对映异构体是噬菌体 RNA 聚合酶的底物,能够与正常的 NTP —样搀入到合成的 RNA 中,硫代磷酸酯(phosphorothioate)对碘/乙醇敏感,可以被其切割,由于碘不带电荷、非常小、反应迅速并且对电泳迁移率没有影响,因此适合足迹试验。这可以作为 ENU 修饰的替代,一来可以加快反应的时间,二来在解释数据时不必进行 RNA 酶测序和降解梯带。

① 合成含有硫代磷酸酯的转录物,进行末端标记并纯化,另外对每一个核苷酸和 0.2 mmol/L (5%)NTPαS 进行一个单独的转录反应,也就是说,对于一个含有 AαS 的转录物必须含有所有的 4 种 NTP,但是也要用 0.2 mmol/L 的 ATPαS 进行一个单独的转录反应。

② 将未结合的 RNA 和 RNA-蛋白复合物在室温下与 1 mmol/L I2 孵育 2 min,进行硫代磷酸酯基闭的切割,同时采用等量的乙醇作对照反应。

③ 用 DEPC-H2O 稀释反应液至 200 μl,加入等体积的抽提缓冲液再次分离 RNA,加入等体积的酚:氯仿,振荡几分钟,混匀,用小型离心机在最高速度离心 10 min ( 约 16000 g),收集上层水相,如前所述加入等体积的氯仿再次抽提,用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA,在干冰/乙醇里孵育 10~20 min,于 4℃ 16000 g 离心 15 min,用冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀,用 5 μl 水和 10 μl 1.5X 点样缓冲液重新溶解沉淀。

④ 在此试验中,由于针对特异的 NTPαS 的切割使得末结合的 RNA 形成测序梯带,从而使凝胶的分析更为容易。

3. 采用碱基特异的试剂进行足迹和干扰分析实验

2 “采用对核糖骨架链特异的试剂进行足迹和干扰分析实验” 中介绍的方法可以对与 RNA 主链作用的蛋白进行研究,然而 RNA 的其他部分如碱基也可以调控特异的 RNA-蛋白相互作用,目前有许多化学试剂可以用来进行试验以获得这些碱基的信息。

(1) 焦碳酸二乙酯

焦碳酸二乙酯(DEPC ) 可以使嘌呤 (A>>G ) 的 N-7 位发生羧乙基化,这种修饰可以被碱基堆积抑制同时也受溶液中二价离子的调节。首先要滴定探针的浓度,此处介绍的操作条件和步骤适合于 VA RNA1。

① 加 2 μl 10X 结合缓冲液,1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA,末端标记的未结合 RNA 或者蛋白 RNA 的复合物,2 μl DEPC,加水到 20 μl,37℃ 孵育 10 min。用水稀释到 200 μl,加入等体积的酚:氯仿,振荡几分钟混匀,用小型离心机在最高速度离心 10 min ( 约 16000 g ),收集上层水相,如前所述加入等体积的氯仿再次抽提,用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA,在干冰/乙醇里孵育 10~20 min,于 4℃ 16000 g 离心 15 min,冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。

② 如果要产生 DEPC 测序梯带或者对用来进行干扰分析的 RNA 进行预先修饰,可将 2 μl DEPC、末端标记 RNA、1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、3.3 μl 3 mol/L 的 NaAc ( pH 4.5 )、1 μl 200 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 混合,加水至终体积 200 μl,90°C 孵育 2 min,加入 25 μl 的 3 mol/L NaAc ( pH 4.5)和 750 μl 乙醇,回收、沉淀 RNA。

③ 第 (1) 步或者第 (2) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L 的 NaAc ( pH 3.8) 重新溶解,加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA。这些 RNA 可以用作干扰分析、进行修饰位点的切割或变性凝胶电泳。

(2) 硫酸二甲酯

硫酸二甲酯(DMS ) 能够使鸟嘌呤(N7 )、胞嘧啶(N3 )、腺嘌呤(N1 ) 的 N 甲基化,只有 G 和 C 的修饰可以采用 Krol 和 Carbon 所述的碱基切割方法检测到。G-N7 反应可以被碱基堆积抑制,而 C-N3 的反应则可被碱基配对所抑制,此处的条件适合于 RV RNA1

① 加 20 μl 10X 结合缓冲液,1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA,末端标记的未结合 RNA 或者蛋白与复合物,加水至 200 μl,加 0.5 μl DMS 于 37℃ 孵育 10 min。

② 如1 “RNA 酶足迹分析” 中步骤 (8) 的方法,使用含有 125 mmol/L 的 β-巯基乙醇 2X DMS 抽提缓冲液回收 RNA。

③ 要产生一个 DMS 的测序梯带或者适合干扰分析的预先修饰的 RNA,可将 1 μl 的 DMS、末端标记的 RNA、1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA、3.3 μl 3 mol/L 的 NaAc ( pH 4.5)、1 μl 200 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 混合,加水至终体积 200 μl,于 90°C 孵育 1 min。

④ 加入 25 μl 3 mol/L NaAc ( pH 4.5 ) 和 750 μl 乙醇,回收、沉淀 RNA。

⑤ 第 (1) 步或者第 (2) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L 的 NaAc ( pH 3.8 ) 重新溶解,加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA。这些修饰的 RNA 可以用作干扰分析或者重溶在 100 μl 水中,分为两份,真空干燥。

⑥ 重新溶解一份在 10 μl 1 mol/L Tris-HCl 中,加入 10 μl 新鲜配制的 200 mmol/L NaBH4, 避光在冰上孵育 30 min,进行 G-N7 位点的切割。

⑦ 重溶另一份在 10 μl 冰预冷的 50% ( V/V ) 无水肼中,冰浴 5 min,进行 C-N3 位点的切割。

⑧ 第 (4) 步或者第 (5) 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L NaAc ( pH 3.8 ) 重新溶解,加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA,重复溶解沉淀一次,RNA 用来进行苯胺的切割。

(3) 苯胺切割修饰的 RNA

① 重新溶解 RNA 沉淀在 20 μl 1 mol/L 苯胺(用 0.3 mol/L pH 3.8 NaAc 新鲜稀释),避光于 60℃ 孵育 20 min。

② 加入 1.4 ml 正丁醇终止反应,短暂振荡,室温下在微型离心机上以最高转速离心 ( 约 16000 g ),小心去除正丁醇,重新溶解 RNA 沉淀在 150 μl 1% ( m/V ) SDS 中,加入 1.4 ml 正丁醇,短暂振荡,如前沉淀 RNA。

③ 用无水乙醇洗涤沉淀,完全干燥,重新溶解 RNA 沉淀于 4 μl DEPC-H2O 和 8 μl 的 1.5X 凝胶点样缓冲液,样品准备进行凝胶分析。同时还需用苯胺处理标记的未修饰的 RNA。

4. 修饰干扰分析

使用预先修饰的 RNA 进行修饰干扰分析可以鉴别与蛋白质相互作用的重要位点。DEPC、ENU、DMS 修饰的 RNA 和含有硫代磷酸酯的转录物都可以进行干扰分析。在变性条件下对 RNA 进行化学试剂的修饰可能使所有的位点都被修饰,对修饰后的 RNA 进 行回收并进行结合反应。RNA 蛋白复合物从未结合的 RNA 中分离出来,如前所述进行蛋白-RNA 复合物的抽提。这些 RNA 在修饰位点进行切割,平行进行未修饰的 RNA 试验以便产生一个测序梯带对照,未修饰的 RNA 也作为没有特异结合的对照,采用变性凝胶电泳和放射自显影对产物进行分析。下面给出了采用肼分析嘧啶碱基的修饰程序。

肼可以去除嘧啶碱基用来进行干扰分析,根据选择的条件不同,反应可以针对 U、C 或者二者进行,此处的条件适合于 VA RNA1。

1. 沉淀未端标记的 RNA 和 1 μl 10 mg/ml 小牛肝 tRNA。

2. 进行 U 特异的反应,重溶 RNA 于 10 μl 的水中,并加入 10 μl 无水肼,在冰上孵育混合物 10 min。

3. 进行 U 和 C 特异的反应同上面所述的相同,只是将 RNA 沉淀重溶在 20 μl 新鲜配制的无水肼/0.5 mol/L NaCl 中,冰上孵育 30 min。

4. 进行 C 特异的反应,将 RNA 沉淀重溶在新鲜配制的无水肼/3 mol/L NaCI 中,冰上孵育 30 min。

5. 第 2、3、4 步沉淀的 RNA 用 200 μl 0.3 mol/L NaAc ( pH 3.8) 重新溶解,加入 600 μl 乙醇沉淀 RNA,重新溶解沉淀一次,回收沉淀用于干扰结合研究和苯胺切割试验。


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