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RNA实验

方案5.9 Fe(II)-EDTA保护测定法

2024-06-20 RNA实验 加入收藏
原理Fe(II)-EDTA 能够催化 RNA 或 DNA 的断裂,是 RNase 保护分析的一个补充方法,其优点是很少或没有碱基序列的特异性,其沿着整个长度的


原理

Fe(II)-EDTA 能够催化 RNA 或 DNA 的断裂,是 RNase 保护分析的一个补充方法,其优点是很少或没有碱基序列的特异性,其沿着整个长度的 RNA 或 DNA 链的剪切几乎是一致的,它可被用于解释一些 RNA 的较高级的折叠方式。

材料与仪器

RNA洗脱缓冲液 退火缓冲液 硫脲 抗坏血酸钠
水浴 垂直电泳装置 暗片盒

步骤

一、材料与设备

1. 水浴。

2. 垂直电泳装置。

3. 暗片盒。

4. RNA 洗脱缓冲液:80% 甲酰胺,40 mmol/L PIPES,1 mmol/L EDTA,0.4 mol/L NaCL。

5. 退火缓冲液:50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 ),50 mmol/L NaCl,10 mmol/L MgCl2

6. (NH4)2Fe(SO4)2 溶液:10 mmol/L (NH4)2Fe(SO4)2 ( Sigma 公司),20 mmol/L EDTA,用前摇匀。

7. 100 mmol/L 硫脲。

8. 0.9% H2O2

9. 10 mmoI/L 抗坏血酸钠。

二、操作方法

1. 制备 RNA:通过 PAGE 纯化末端标记的 RNA,用 RNA 洗脱缓冲液抽提含有 RNA 的凝胶条块,再用乙醇沉淀 RNA。

2. 退火:以使 RNA 形成适当的结构。用 50 μl 的退火缓冲液将 RNA 浓度调整为 25 mmol/L,95℃ 加热 2 min后,置于冰上 1 h。

3. 反应:将 7 μl 的 RNA、1 μl 10 mmol/L (NH4)2Fe(SO4)2 溶液,1 μl 10 mmol/L 抗坏血酸钠和 0.9% 的 H2O2 混合,于 20°C 温育 10 min 后加入 1 μl 100 mmol/L 硫脲以终止自由基反应。

4. 检测:用含 8 mol/L 尿素的 10%~15% PAGE 和放射自显影对切割产物进行分析。


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