基因的PCR扩增（聚合酶链式反应）

实验原理  单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（Primer），合成的互补DNA称为产物DNA。双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA，它们都可作为单链模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出产物DNA。 PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA 5’端的引物（Pl）对应于上链DNA单链的序列，3’端的引物（P2）对应于下链DNA单链的序列，Pl和P2按5’→3’方向相向配置。 在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。 引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增，所以这一反应称为聚合酶链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量能够满足，则这一过程可无限重复，使模板DNA无限扩增。 PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上，因此能用微量样品获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆，成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。  常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为25～35，变性温度为94℃，复性温度为37℃～55℃，合成延伸温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），DNA扩增倍数为106～109。  引物的设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则： ①引物长度：15~25个核苷酸。 ②CG含量为40%~60%。 ③Tm值高于55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)计算]。 ④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%。 ⑤两条引物间配对碱基数小于5个。 ⑥引物自身配对（特别是在引物的3’端）形成的茎环结构，茎的碱基对数不大于3。 由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。 实验材料和试剂     （一）试剂 1.  4×dNTP：     1 mmol/L          dATP 1 mmol/L          dCTP 1 mmol/L          dGTP 1 mmol/L          dTTP 2.  Taq酶：5 U/ml 3.  模板DNA：0.1 mg/ml 4.  引物：Pl： 5'-TTCCATATGCCTACTTCAAGTTCT-3' P2：5'-ACCTAAGCTTGCTTCAAGTTAGTGT-3' 引物溶液浓度：50 nmoI/L （二）器皿  0.5 ml薄壁Eppendorf管 （三）仪器  PCR自动扩增仪              离心机                                微量注射器                  微量移液器                          电泳仪                      水平电泳槽                   透射紫外观察仪 实验步骤  （一）准备PCR反应溶液  1.  取薄壁0.5 ml Eppendorf管一只，用微量注射器按以下顺序分别加入各试剂。          10×缓冲液             10 ml          4×dNTP               10 ml          引物Pl                   1 ml          引物P2                 1 ml          模板DNA               1 ml          Taq酶                   1 ml          加无菌双蒸馏水至      100 ml  2.  用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。  3.  加石蜡油50 ml封住溶液表面。    （二） PCR扩增反应  将加好样品的Eppendorf管插在PCR自动扩增仪样品板上，95℃10分钟，使模板充分变性。然后按以下步骤在PCR自动扩增仪中进行反应，25～35个循环。      93℃                30秒      55℃                45秒      72℃                45秒  反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用。     （三）结果检测  本实验PCR扩增的产物DNA片段长度为609 bp，适合于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。