定量PCR的应用与开发

1.应用开发指南 2.引物设计软件 3.实验设计思路 4.技术应用举例

应用开发指南

应用开发基本流程

•探针设计指南 –免费赠送Primer Express软件 –TaqMan探针Tm68ºC -70ºC –MGB探针Tm65ºC -67ºC •引物设计指南 –引物Tm58ºC -60ºC –短PCR产物50-150bp •PCR程序指南 –通用的PCR条件 2步法：95ºC @15sec, 60ºC @ 1 min •实验条件快速优化指南 –所有实验在同样条件下完成 –固定的PCR 试剂 浓度2X TaqMan®Universal PCR Master Mix –只需简单优化引物/探针浓度

引物设计指南 1.先设计探针，再设计引物； 2.引物要尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠； 3.G-C含量保持在30-80%之间； 4.避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或更多的G； 5.用Primer Express ® 软件计算出来的Tm值应当在58-60 ℃之间； 6.在引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个。

为什么要避免3’端的G和C？ Design rule:5 nucleotides at the 3" end have only 1-2 G+C’s Transient binding at 3" end of probeis quickly stabilised by the DNA polymerase