逆转录（RT）实验步骤

一、准备工作

1、实验器具与材料：

（1）移液枪：200ul、10ul

（2）吸头：200ul、20ul

（3）EP管1。5ml、100ul

（4）水浴箱

2、实验器具的处理与准备

塑料制品：（包括吸头、EP管等）

将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

3、试剂配制和准备：

（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1。5mlEP管中，-20℃中保存备用。

（2）RT中所需要的各种试剂

（3）引物浓度计算方法：（新合成的引物的稀释）假如终浓度为XuM（pmol/ul）加DEPC水体积（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）

二、RT时注意事项：

为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。

三、RT步骤

（一）用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）

1、准备0、65ml的EP管

2、冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。

3、65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。

4、短暂离心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAse Inhibitor，1ulSSⅢ逆转录酶。

5、短暂离心

6、50℃水浴60分钟进行逆转录。

7、70℃水浴15分钟灭活逆转录酶

8、－20℃保存，或立即进行PCR。

（二）用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）

1、准备0.65mlEP管

2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA

3、稍离心，100℃沸水裕1min

4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆转录酶

5、稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT

6、100℃沸水裕3min灭活AMV

7、立即PCR或－20℃保存。