引物（primers)设计知识介绍

引物（primers)

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

引物的重要性

在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。

引物与PCR

引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L

引物浓度（uM）=n OD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2O VH2O （单位：L）

退火温度

最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 ×（Tm of primer） 0.7 × （Tm of product）– 25

一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。

引物设计软件

Primer Premier 5.0

生物软件网下载

安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。

Oligo

primer 3

The Primer Generator

NetPrimer

引物同源性分析

用Blastn软件进行同源性比较

尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物

选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物

选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源的序列作为引物