聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)

聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。

PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。

在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。

PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。

由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。

为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。

这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时，利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。

利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物，均可使产物信号增强几个数量级。二者相比较，前者经济、扩增特异性强，多用于大样本的检测和筛选；后者操作简便，适于一般实验室开展，可用于小样本或大样本的检测和筛查。本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。

一、试剂准备

⒈　PCR相关试剂

⒉　α-32P-dCTP

⒊　30％聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddH2O中，4 ℃保存。

⒋　10％过硫酸胺配制方法：1g 过硫酸胺，溶于10ml ddH2O中，4 ℃保存（可用数周）。

⒌　TEMED（N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）

⒍ 5×TBE缓冲液：Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。

7．变性上样液：95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、 20mM EDTA(pH 8.0)

二、操作步骤

⒈ PCR扩增

反应总体积为10μl，在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分：

10×buffer 　 1μl

dNTPmix 　　 70μM

DNA模板 100ng

引物及Taq DNA酶 依实验设计要求按比例加入

α-32P­-dCTP 　 0.1μl

加ddH2O至 　 10μl

按实验设计循环参数进行扩增，获取扩增产物。

⒉ 聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑴ 电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，晾干，95％乙醇擦拭，自然干燥。用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上， 5～10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐，用固定夹夹紧两块玻璃，并用玻璃胶带封边。

⑵ 制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用5％～8％的凝胶较为合适。轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气（开始时要缓慢）除气泡，加35μl TEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混匀。

用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液，将玻璃模具倾斜成60O角，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。

由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。将封口玻璃胶带掀去，放入电泳槽，凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽，用大号固定夹固定住两侧。在上下电泳槽内灌入 1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。

⑶ 扩增产物的处理：将 PCR扩增产物与变性上样液按1：5的比例加入0.5ml　微量离心管中，混匀。样品上胶前应98 ℃变性10min，立即冰浴骤冷。取约3～5μl变性样品（根据点样孔的大小决定上样量），以微量加样器上样，（上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散）。

⑷ 电泳：电泳槽接上电极（上槽接负极，下槽接正极）开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。

⑸ 剥胶：电泳结束后，倒弃电泳缓冲液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。剪一张与玻璃同样大小的滤纸，严密覆盖于凝胶上，顺一个方向将凝胶缓慢取下，用保鲜膜盖于胶面并包好，避免膜和胶之间产生气泡或皱折，将凝胶固定在X线片夹中。