基因克隆策略与引物设计原则

1、功能基因克隆的基本策略

① 根据已知的脊椎动物某一特定基因的氨基酸序列的保守区域设计简并引物，利用RT-PCR技术获得该基因的核心片断，将该片断分离纯化后与T载体连接，转化大肠杆菌，挑取白色菌落，经 PCR反应鉴定得到阳性克隆，送阳性克隆的PCR产物去测序，从而获得目的基因的cDNA核心片断的序列。

② 利用3'-RACE 和5'-RACE 技术扩增cDNA的3‘末端和5’末端，将cDNA核心片断、3‘末端和5’末端进行序列拼接，从而获得全长cDNA序列。

③ 通过基因组PCR获得内含子DNA序列，通过基因组步移技术进一步克隆该基因的5‘侧翼序列（含启动子及其它顺式调控）和3' 侧翼序列，从而获得该基因的基因组DNA全序列。

2、引物设计基本原则

细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物只跟目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会扩增出其他非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性引物所具有的令人满意的特点：

① 典型的引物长18-24bp.引物足够长，保证序列特异性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24bp 的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

② 选择GC 含量为40%-60%.高GC 含量导致形成稳定的不正确的配对，而高AT 含量降低正确配对的Tm值。

③ 设计5’端和中间区为G 或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

④ 避免多碱基序列（如poly dG）或者重复结构域的延伸--它们能够在模板上进行不正确的配对。

⑤ 避免在PCR反应中使用与其它引物互补的序列，以阻止引物之间的配对，形成引物二聚体，抑制扩增。

⑥ 在引物5‘末端加入限制性酶切位点序列时，一定要包含几个额外的碱基（2-6碱基）作为固定，以防止5’末端在消化时的移动。