细胞运输和保存：可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式： （1）干冰运输，收到后 立即转入液氮冻存或直接复苏； （2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细 胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

 

细胞用途：仅供科研使用。

 

细胞接收后的处理：

1） 收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细 胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2） 在显微镜下确认细胞生长状态时，最好在低倍镜（4 或 5X 物镜)下进行，能 准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在 10X 和 20×物镜下，同时给刚收 到的细胞拍照，（10×，20×）各 2-3 张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细 胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。

3）观察好细胞状态后， 75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

4） 贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落 或者脱落后抱团生长，可将 T25 瓶置于 37℃培养箱放置约 2-3h，然后抽出瓶中 的培养基和未贴壁细胞 1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照 说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。

5） 悬浮细胞：T25 瓶置于 37℃培养箱放置约 2-3h，然后抽出瓶中的培养基和 细胞 1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说 明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。

6）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说 明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后第一次传代建 议 1：2 传代 。

 

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备 L15 基础培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%，MEMNEAA 非必 需氨基酸 1%

2）培养条件： 气相：空气，100%；该细胞培养不能通入 CO2，如果没有条件 准备空气气相 100%的培养箱的，可以采用不透气密封盖的 T25 培养瓶来培 养，培养过程中每天将细胞拿出培养箱换 1-2 次空气。温度：37 摄氏度，培 养箱湿度为 70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检 查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。 1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。 2. 加 2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部 分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止 消化。 3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。 4. 将细胞悬液按 1：2 到 1：5 的比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者 瓶中。 注：第一次传代推荐传代比例为 1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。 3） 细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃 去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约 1ml 含血清的培养基后 加入冻存管中，再添加 10%DMSO 后进行冻存。 下面 T25 瓶为例； 1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗瓶底 1-2 次后加入 1ml 胰酶，细 胞变圆脱落后，加入 2ml 完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。 2．1000RPM 离心 5 分钟去掉上清。用血清重悬浮，加 DMSO 至最终浓度 为 10%。加入 DMSO 后迅速混匀，按每 1ml 的数量分配到冻存管中，注意 冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于 1X106个细胞冻存。 3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，至少 2 个小时以后转入液 氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

注意事项： 1. 收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即 与我们联系。 2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意 防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。