A组轮状病毒感染的诊断

A组轮状病毒感染的诊断 　　在腹泻病的病毒病因中，轮状病毒(Rotavirus简称RV)为主要病因，在经济发达国家，急性胃肠炎住院的婴幼儿中约1/3-1/2以上是轮状病毒腹泻，而在发展中国家，腹泻病每年造成500-1000万婴幼儿死亡，轮状病毒为主要病因，在我国，情况更加严重，我国不仅与世界其李国家要样遭受婴功儿(即A组)轮状病毒的危害，而且还受到成人腹泻轮状病毒Adult Diarrhea Rotavirus即ARV，B组)爆发流行的威胁。显然，我国比其他任何国家者更应当重视轮状病毒腹的研究。 (一)病毒特性 　　1.一般特性:RL属呼肠孤病毒科(reoviridae)中的一个属，1973年澳大利亚学者Bishop首先在婴幼儿急性腹泻的十二指肠超薄切片中发现其命名了由Elewett于1974提出，"Rota"在拉丁语为"车轮"，因此病毒在EMF状似车轮故名。RV完整颗粒为直经70nm左右的正二十面立华对称华，核心为一个分为11个节段的双链RNA(dSRNM)基因组(genome)，外面包有两层蛋白外壳。RV颗粒在粪便样本和细胞培养中以三种形式存在:一种是含有完整外壳的实宽心光滑型(L型);另一种是不含外壳而仅含内壳的粗糙型(D型)，约55nm大小;第三种为病毒核心结构，约37-40nm呈的显的六角形。L型颗粒肯有感染性，其外壳糖蛋白能与刀豆素A(ConA)起反应，在Cscl密度样度中的浮密度为1.369/cm3，沉淀系数为520-530S';D型颗粒不肯有感染性，不能与ConA起反应，在Cscl中浮密度为1.28g/cm3，沉淀系数380-400S，在D型和L型颗粒中都含有依赖于RNA多聚酶，但其仅在D型中有活性。 　　RV对理化因子的作用有较强的抵抗力，耐乙醚氯仿，反复冻融，耐酸、耐碱、3.5-10.0保持感染力，病毒对蛋白水解酶敏感，经胰蛋白酶处理后，可提高病毒感染性，因而，在分离培养病毒时加胰酶是必要的，病毒可被氯、二氯化氯、臭氧灭活作为消毒剂来说，以乙醇最佳。 　　2.化学特征:(1)基因组结构:RV的核酸为双链，分节段的RNA，11个段的分子量在0.2-2.2×106 MDa范围，总分子量约10-14×106MDa，在所有病毒中唯独RV是分为11个片段的基因组，因此这是独有的鉴别特征。近提来乙完成不同轮状病毒株基因组的核苷酸序列分析，发现类似流感病毒，不同株问基因组的序列有较大差异，存在着"飘移"(较小的序列论变)和"转变"(较大的序列改变)现象。这种变异是轮状病毒多种血清型的基础，也含疫苗的研制带来极大的困难，在聚丙烯酰胺凝(PAGE)胶电泳上11个片段可依次分开，这种迁移区带图称RV电泳型(electrophere type)，11个片段可分四组，不同的组其电泳型不一样。按照基因结构和群抗原上差异，RV至少可分、A、B、C、D、E、F(G)6(7)个不同的组群[A组RV即最早在婴幼儿腹泻患者的十二指肠和粪便中发现也称典型RV(typical rotavirus)其他组RV流称为非典型RV(atypical rotavirus)迄今为止，除A组外，其它组RV都还不能在细胞培养上生长。除A组外，还有B组RV也可引起人类腹泻，B组即成人腹泻轮状病毒(ADRV)，同我国学者洪涛发现](论后)有不少迹象说明，RV还存在人畜菜患问题。

人和动物中RV的分组特征 　　多年来把基因电泳图型作为鉴定和诊断RV组别的重要标准，实际上这种划分只有暂时的或参考性的意义电泳型只是反蚋病毒RNA基因组的差异和变异，尚小所作为病毒分类和抗原鉴定的依据，研究表明，在同一组RV中，电泳迁移很不相同的毒株，由于RV基因组的切段性，当两个RV株同时侵染宿主细胞后，基因组节段这间发生重排。Flores等证实，新的流行株主要是由于不同株间的切段重排和基因组内部的突变引起的。[据亚群株株特异性还将A群(组)RV分为两个亚群，亚群I(SGI)和亚群Ⅱ(SGⅡ)、Greenburg等用杂交瘤技术制备发抗SGI、SGⅡVP6的亚群特异性中和抗体，用以区分RV的亚群，分析表明，多数RV株属于SGI，近年发现VP2也是病毒亚群抗原，并且按VP2区分亚群和按VP6区分亚群的结果不完全一致，按VP2抗原特异性分为VP2a，VP2b并与SGI、SGⅡ组合成为RV株所属亚群]。另外根据10和11节段迁移本上的差别，把A组(群)RV分为长型(10、11片段泳动较快)和短型(10、11片段泳动交慢)，[以前认为人RV电泳型长型属SGⅡ，短型属SGI、但现已发现肯有"起短"RNA型的人RV及属于SGI，带有长RNA电泳型的病毒]论后。至今，已对A组RN11个基因中的6个进行了克隆和序列分析。这些基因的共同特点是:1)具有保守的5'和3'未端序列，即正链(+)病毒RNA:5'GGCUUUAAA..A.UUGUGACC3'。2)具有单一的开放读码杠架。3)缺少聚腺苷化序列(poly adenylation sequence)，序列分析结果还表明A组RV的型问基因序列有相当大的同源性，不同病毒组成RNA基因组的碱基对数目不一，即使同一血清型不同毒株碱基组成也不尽相同。 　　(2)基因产物──蛋白多肽及其功能 　　完整的RV颗粒有多个病毒多肽，不同学者报道数目不一，不同宿主不源的RV，同一多肽的分子量不尽相同。每一个病毒蛋白多太由不同基因片段编码。在病毒外壳上有两个重要的结构蛋白UP7和VP3。VP7由基因9(或7.8视不同同毒株而定)片段编友，引出中和抗体，是一个糖蛋白，是病毒主要中和抗原;VP3由第4基因编码，它与限制病毒在组织培养上的生长繁殖密切相关，也是病毒的轿凝等，也有中和病毒作用，并且越来越多的实验表明基因4编码的VP3在免疫反应中起着重要作用，VP3可介导异型间的交叉保护性免疫，它可被蛋白水解酶水解。水解后可使病毒感染性增强，基因6的产物VP6是内壳蛋白，是普通RV的共同抗原，并且有亚组(群)特异性，轻状病毒外壳蛋白VP4、VP7及内壳蛋白VP6与碥码蛋白的基因，对于A组RV上前已基本确定每个基因的功能及其编码多肽。 (二)流行病学 　　无论在发达或发展中国家，A组RV引起的腹泻都有较高的发病第，是婴幼儿发病和致死的重要病因。在发展中国家，为婴幼儿致死的仅次于呼吸道感染的第二位病因。RV腹泻发病率最高的人群是6-24同龄的婴幼儿，其发病第可高达45-62，男女性别对RV均易感，但亦有男性发病第高于女性13%的报道，但一个很值研究的矛盾总是新生儿粪便中含RV的阳性率甚高，约50%以上，但并不发病。有人认为新生儿粪便中的RV是无毒株，有研究表明该毒株存在独特的第4基因序列，这可能是区别于婴幼儿的RV肠炎株的基因差别所在，所以用来做候补疫苗株，也有人认为这与新生儿肠道上皮细胞的成熟状况有关，另外营养不良在RV感染果可使病情加重并可能是导腹泻死亡的一个重要原因。典型的RV腹泻为秋冬季发病，热带和亚热带地区则全年均广泛传播，流行的型别各地报告不尽一致，我国以1，2型为主。长短型常交替流行，美国报告，在238例中75%属SGⅡ，25%属SGⅠ。1990年我国赵锦铭等报导，来自全国13省市740例标本中SGⅡ占61.3%，SGⅠ占37.3%，混合型占1.4%。RV感染属非侵入性的，病毒在小肠表层繁殖，并产生大量代病毒随粪便排出体外。粪一途径是RV传播的主要途径，此外水源污染，呼吸道空气传播，院内和幼托所及家庭成员中的密切接触均可造成流行，还有人推测，动物可能是作为人感染RV的重要传染源。一些社会因素如文化经济状况，公共卫生设施等对RV腹泻流行也有影响，在不发达国家中病人腹泻次数多，持续时间长，脱水现象严重，导致死亡率高于发达国家。 (三)临床表现 　　婴幼儿轮状病毒腹泻潜伏期1-3天，发病初期伴有低热和哎吐，继而腹泻，呈水样便，幼儿可腹痛，大多发热在37.9-39.5℃之间，30-50%有呼吸道症状。腹泻大多一天10次以下，多者可达20次以上，大样呈水样，乳白色或淡黄色，无浓血或粘液，有恶臭，排便较急，量多，此为RV腹泻粪便性状的特点。患儿胃纳差，进食少，很容易发生等渗性脱水和代谢性酸中毒，平均需住4天，个别是病程可连续至30天，大多为轻症，但也有致命症，多死于严重脱水及电解质紊乱。少数患儿有肝脑综合症(Reye's综合征)、中毒性脑炎、直肠出血、肠套叠等并发症。新生儿中可有发病，曾有婴儿室暴发流行报告。40-50%新生儿排毒，但临床症状轻，无死亡。 (四)实验室诊断 　　目前检测RV感染的方法主要依赖于电镜(EM)或免疫学测定，如免疫酶联吸附(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)免疫荧光(immuno-fluorescent test IF)、放射免疫(rodio-immuno Assay，RIA)补体结合(complement fixation test，CF)、血疑测定(HA)及对流免疫电泳(Curveut lmmune Electrophoresis，CIEP)等，但由于HRV培养较困难，获患儿恢复期血清运转困难，在实际应用中免疫学检测常出现假阳性或假阴性结果。所以，近年随着分子遗传学等的发展，建立了更为特异和敏感的检测方法，如RNA核酸杂交，聚合酶链反应检测RV核酸存在及RNA电泳图型法，现分述如下: 　　1.电镜(EM):P368，有时也用免疫电镜和超薄切片电镜检查法，此法在HRV诊断中的作用受到高度评价，但由于受设备限制，较难推广。 　　2.酶免疫吸附试验(ELISA)P369，双夹心法(double sandwich method)是目前最为常用的ELISA法:即包被第一Ab(抗VirusAb)+染测标本中Ag+检测Ab(豚鼠抗病毒Ab)+酶标Ab(单抗豚鼠Ab+物、显色、读取结果、WHO将此法列为诊断RV的标准方法，国内外都已有ELISAHRVKit商售，最近已生产出抗HRV的McAb使ELISA的度大大提高，而且型特异的McAb可以分型研究， 　　3.补洁(CF):将粪便或组织细胞培养中轮状病毒提片，浓缩后作为抗原，以动物RV的"O"因子作为补洁抗原，检测人血清中抗人RvAb为克服粪便的抗补作用，可在标本中加牛血清处理后提纯Ag。 　　4.放射免疫试验(vadio-immunoassay，RIA):目前常用固相致免疫测定法(Solid phase radio-immanosassqy，SPEIA)免疫RVIg(捕获Ab)包被微量板+染测含RV标本+豚鼠抗RVIgM(检测Ab)+125I标记羊抗豚鼠IgG(指示Ab)，在计算机上测cpm值，此法已标准化，制成统一的微量板可快速地于一天内得到结论。 　　5.对流免疫电泳(current immune electrophoresis(IEP)将等测粪便悬液(Ag)与不同稀释浓度的人或牛RV抗血清分别加入邻近的醇指小孔内，经电泳后Ag与抗血清小孔间可出现深浅不同的Ag-Ab凝聚沉淀线，以考马斯亮(Coomassie blueP)染色使沉淀线的分率更高，但此法不十分灵敏可靠，现不常用。 　　6.PAGE:RV在粪便中含量高达10'病毒颗粒/g，故可从粪便中直接提取dsRNA、其对RNA酶的降解有强的抵抗力，另外粪便中其它肠道病毒核酸不会进入用于检测RVdsRNA的聚丙烯酰胺凝胶，提取的dsRNA经10%PAFE分离，EB和AgNo3染色后，呈现RV特有的11条带，此法敏感，特异准确可靠，在诊断RV感染，确定流行期病毒种类，病毒漂移和转变及基因重排分析等方面有重要的参考价值。 　　7.核酸探针杂交: 　　首先从标本中提取病毒dsRNA，其可在溶液中或在固相支持物上(如NC膜或尼龙膜)，与其互补的P2标记的DNA或RNAprobe进行杂交，通过检测标记的probe观察是否有阳性杂交反应，杂交的敏感性与prebe序列的长度成正比。 　　8.聚合酶链反应(PCR):PCR自1985年由美国Cotus公司的Saiki等研究成功后，已被大量地用于检测人体内病毒核酸序列，具有敏感特异，简便和快速等优点，针对RV苯-基因的保守序列，合成两个引物，将抽提mRNA反转录后在体外扩增，如果得到特征性片段，则可证实RV的存在。国内外用PCR方法已对PV进行了大量的研究，不仅仅对RV进行检测，还进行RV和血清型鉴定，应用体外中和试验进行血清型鉴定要求每种病毒适于培养，并可被相应的血清所中和，目前尚不具有所有RV血清型的McAb，加之RV有VP4和VP7两个不同的中和抗原，因而用一般的免疫血清中和试验，EIA和IEM等都较困难，方法也较繁杂，而分别从编码RP4、VP7基因的分子水平设计的方法则比较简单易行。 　　通过不同血清型VP7的氨基酸序列的比较研究，发现有6个区域的氨基酸排列具明显的多样性(变区)，与6个RV血清序列则高度保性，分析VP4的氨基酸序列也有类似的发现。所以分别造反编码VP7和VP4基因的高保守序列设计引物，先经逆转录cDNA PCR一次放大后，再分别造反基因内不同血清型的特征序列设计一组分型引物，与另一端的保守序列引物酸对，经二次PCR放大，从放大产物的特征分子量大小，区别RV样品的不同血清型。 　　常用的引物序列为:5'-3' 　　Pr1,GTAGGTATTGAATATACCAC51-71A组RV 　　Pr2,GATCCTGPTGGCCATCC392-376第九基因片段长342bp 　　Pr1,AATTCTCGCTTTTAAAGCCA组RV中和抗原(VP1) 　　Pr2,TAGAGTTGTATGATGTGACC的完整第8基因，第1.1kb (五)疫苗研究进展 　　自80年代，RV体外培养获得突破性进展以不，已对其生物学特性，流行病学，RNA电泳型，血清型及病毒蛋白功能，核酸基因组;遗传变异，基因工程等分子生物学方面做了大量研究，取得了较好的成绩，也为有效疫苗的研制奠定了基础。尤其近年疫苗研制方兴未衰，国内外多致力于有效疫苗的研制，以其能预防，切断流行，达到保护性免疫的效果。 　　到目前为止，已经提出的RV具有菜有的群抗原，且研究发现感染了RV的患儿血清不仅能中和人RV，而且还能和牛、猴等RV发生反应，因此认为，减毒的动物RV能和牛痘痘苗一样在人体中诱导保护性免疫。主要有三个非人类宿主的成毒异种候补RV疫苗，其中RIT4237是研究得最为深入的成毒苗，这是由比利时的SmithKline-TIT所发展的，是牛RVNCDV(Lincoln)株在牛胚肾细胞中传代174次，尔后又在非洲猴肾细胞中传7次而得到的冷适应株，在芬兰进行的现场试验表明，RIT4237苗对重症腹泻的保护率为82%-88%。但它的重要缺点是不适于发展中国家便用，在秘鲁和非洲卢晴天这，比亚的现场试验表明，其免疫原性低，不能提供有效的免疫保护。另外RIT4237作为疫苗的实验室减毒技术尚未见报导。 　　另一有希望的疫苗候选株是猴RVRW-1株由美国国立卫生研究院Kapikian等与瑞士和瑞典协作研究。是将PRV在原代或第二代猴肾cell中培养传代9次KS，在DBS-FRhl2cell中传7次而得到减毒株MMU18006，些株免疫原性较RIT4237子，可中和人RV第3型，在美国马里兰州，么内瑞拉和芬兰的Ⅱ期临床试验表明，104pfu剂量已能诱导较好的保护免疫。Wister-merieux牛株设苗是由美国费城Wistar研究所和法国Merenx研究所联合研究的低传代牛RV疫苗，现正在美国进行初步试验，冷适应人血清，型RV疫苗，正在日本研究，其安全性、免疫原性正在做动物实验。制备成毒活疫苗的另一有效途径是基因重排，以减毒RDN作为减毒基因供体，与不同血清型HRV共同感染宿主。在RRV的超免疫血清的选择压力下筛选重排病毒，使其基因9(编码VP7)来自HRV，而其它片段来自RRV。也可发展"裁剪拼接"将不同来源RV中具有流行病学重要特性的片段混合到一个新病毒上，使重组病毒既含有某种动物RV的组织培养适应性，同时又有新的免疫性，以此为"控制株"来发展疫苗重组病毒Greenberg等用牛RVUK株和猴RV，而其它片段来自RRV4个血清型单一基因重组株，这些满意的成毒和遗传学稳定性，这种多价重组疫苗正在由Kapkan等人在世界各地12个现场进行试验。Flores等也分别得到了1、2、4型人RV和RRV(3型)的重排毒株，在美国罗彻斯特和这个地摩地区的现场实验证明疫苗是安全的，具有一定免疫原性，卫生部兰生所中硕，白植生等人用羊RVLc40株和猴RVSA11株混合感染细胞培养进行了基因重配试验，在第一代即获得了基因重配株，并且组建成以羊RVLc40弱毒株为遗传背景，重配VP73型基因片段的疫苗株(L-S9株和L-S4，9株)，为我国进一步研制RV活病苗提出了新途径。 　　2.亚单位多肽疫苗:与保护性免疫有关的多肽是VP4和VP7，并且研究表明不同血清型RVVP4的aa序列不同源性比较高(相对VP7布景言)，因此，可能能诱导型间的交叉保护免疫故VP4在疫苗研制中越来越变重视。自1981年以来，VP4、VP7的基因已相继被克隆，但如何使这些克隆的基因组在原核或真核中高效表达，最终产生有免疫原性，实用价值的疫苗，目前仍处于研究阶段。 >

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