神经母细胞瘤造模方法（二）——原位荷瘤

神经母细胞瘤是一种幼儿发育性肿瘤，是1至5岁儿童死于儿童癌症的主要原因，占所有儿童癌症死亡率的15%，严重威胁儿童生命健康。

该病由身体多部位的未成熟神经细胞发展而来，通常起源于腹部或胸部的交感神经，最常起源于肾上腺。

不同疾病起源及扩散部位的患者会表现出不同症状，如腹胀、腹痛、呼吸困难、皮肤肿块、骨痛等。

构建相应的荷瘤小鼠，有助于研究其具体的发生发展机制，探索可能的临床治疗新方法。

神经母细胞瘤肿块压迫脊髓的患者脊柱MRI，箭头指示处为肿瘤肿块。

研究该病时，常采用的小鼠模型有异种原位移植模型和异种皮下移植模型。

上期，我们介绍了皮下移植模型，本期主要介绍异种肾上腺原位模型。

手术器械（眼科镊、眼科剪、持针钳）、耳号及耳号钳、带线缝合针、手术铺巾、棉棒、碘酒、1mL无菌注射器、复苏加热板、麻醉剂（2.4%三溴乙醇）、庆大霉素注射液、小鼠体重秤、剃毛器。

造模动物主要包括重度免疫缺陷的NCG小鼠和裸鼠。本文以NCG小鼠为例。

选取8周龄左右、体格健壮、四肢有力、被毛顺滑光亮无外伤、体重在20g左右（上下浮动不超过1g）的NCG小鼠。

随机分组，每组6只，并打上耳号。

1. 制备细胞系：将人源神经母细胞瘤BE2C-dsred细胞进行体外培养，经传代、纯化，制备成细胞系。

2. 扩大培养细胞：注意定期更换培养液，保证营养供应，使细胞处于最佳状态。

3. 制备细胞悬液：将对数生长期的细胞用酶消化法制备成单细胞悬液，离心浓缩，计数板计数活细胞（台盼蓝染色），将浓度调整为1×10⁶个/20μL，低温保存。

4. 小鼠麻醉：称量小鼠体重，按100μL/10g体重，腹腔注射2.4%三溴乙醇（97%三溴乙醇，使用生理盐水1:40稀释）麻醉小鼠。

5. 备皮消毒：待小鼠翻背反射消失后，使用电动剃毛器进行背部剃毛，碘酒消毒皮肤。

6. 细胞移植：用眼科剪在小鼠背部偏左侧剪开，找到肾上腺，用1mL无菌注射器将20μL单细胞悬液接种于NCG小鼠左侧肾上腺原位，此时肾筋膜处可见明显鼓起，注射器针头缓缓退出，用带线缝合针缝合伤口。

7. 术后护理：

1）将麻醉中的小鼠转移到复苏加热板上，等待小鼠苏醒。

2）在小鼠平日饮水水瓶中按200:1的比例加入庆大霉素注射液以预防伤口感染。

如果移植的是带Luciferase基因的稳转细胞，四天后可通过腹腔注射luciferin，使用小动物活体成像系统检测荧光，检验荷瘤是否成功。

1. 单细胞悬液保证在低温环境下保存。

2. 细胞计数尽量准确，组别之间不同细胞的计数尽量一致。

3. 手术操作需在无菌环境下进行，手术器械提前灭菌。

4. 手术剪开位置尽量避开肋骨。

5. 注射前将细胞悬液轻轻地充分吹散，防止细胞成团降低细胞成活率。

6. 注射时注意针头插入位置位于肾上腺尖部，插入方向对准肾上腺与肾脏衔接处。

7. 为加快小鼠苏醒，可将小鼠放置于加热板上。