PCR反应体系的污染的对策

PCR可从痕量的DNA扩增出大量的DNA产物，由于它的高度敏感性，使PCR也特别容易受到污染。如果一对引物多次使用或以靶序列扩增产物的有无作为诊断的标准，那么必须消除污染以得到有意义的PCR结果。

污染的DNA可能有三个来源：来自其他测试样品的DNA，来自实验材料如重组克隆的DNA，或者来自同一靶序列的前一次PCR的扩增产物。最后一种污染，通常称为“遗留”（carryover）污染，是最为麻烦的一种。

1、污染的预防

扩增中最可能造成交叉污染的方式是由产物或标本的气溶胶带来的污染(空气污染)。 一般来讲,在标本的加工制备、旋涡振荡混合、打开反应离心管、加样及取下吸头等过程中，都可能产生这种气溶胶。

因此在PCR操作过程中一定要消除或减少这种气溶胶的生成。为此要注意下述事项:

①分隔操作区域是最重要的预防措施，PCR操作区可划分为标本处理区、反应混合液制备和PCR扩增区以及产物分析区；

②小量分装所有试剂；

③配制总反应混合液；

④样品制备应按无菌操作的原则进行，避免样品间的相互污染；

⑤备置专用的微量可调加样器，这套加样器不能用于模板DNA的吸取及反应后的结果分析；

⑥戴一次性手套操作，使用一次性吸头及试管；

⑦最后加入样品DNA。

2、污染的处理

许多方法都可以对环境、器械、反应液的污染进行有效的处理，较为简单易行的方法有：

①酸处理法：用1mol/L　HCl擦拭或浸泡器械的部件使残存的DNA脱嘌呤；

②UV照射法：UV波长一般选择在254～300nm，照射30min即可。此法对长片段DNA有效(500bp以上)，对短片段效果不大；

③DNA酶I法：在PCR混合液(不加模板和Taq酶)中加入0.5U DNA酶I，室温下作用30min后加热灭活。然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR；

④内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶，最好几种合用，可克服一种酶的识别序列特异的缺陷。