双向电泳技术

蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心.双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli 蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化.双向电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿pH梯度分离,至各自的等电点;随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离.目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10 000个斑点(spot).当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候,蛋白质组的分析变得可行.

样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效,目标是尽可能扩大其溶解度和解聚,以提高分辨率.用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白,两者联合有协同作用.对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物质.理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理.而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换.三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键,增强了蛋白的溶解度,并导致转至第二向的增加].两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度,作为互补试剂会更有效.在保持样品的完整性的前提下,可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA).除此之外,机械力被用来对蛋白分子解聚,如超声破碎等.另外,添加PMSF等蛋白酶抑制剂,可保持蛋白完整性.由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的,可在其水化的过程中加样,覆盖整个IPG胶,避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失].此外,低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能,代表蛋白质组研究的“冰山之尖”,故分离低丰度蛋白是一种挑战.亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15 mg级的标准)、应用敏感性检测,可以提高其敏感性.如一种多肽免疫 2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测.提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点.由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生,对PI(等电点)超过10的碱性蛋白,通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之.亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.?

2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性.高分辨率确保蛋白最大程度的分离,高重复性允许进行凝胶间配比(match).对2-DE而言,有3种方法分离蛋白:1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技术为基础.第一向应用载体两性电解质(carrier ampholyte, CA),在管胶内建立pH梯度.随着聚焦时间的延长,pH梯度不稳,易产生阴极漂移.2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH>7.0).如果聚焦达到平衡状态,碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失.因此,在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成,但很难控制.3)IPG-DALT发展于80年代早期.由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题.IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度,克服了IEF的缺点,从而达到高度的重复性.目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线,范围或宽或窄的pH梯度.新的酸性pH 3～5或碱性pH 6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组 重叠群(proteomic contigs)从而有效分离.

分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要.所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的.此外,还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性.目前,没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术.银染已成为一种检测2-DE的流行方法,可检测少到2～5ng的蛋白,因此较考马斯亮蓝R-250敏感.多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色,一些有机染料不适于PVDF膜.放射性标记不依赖其代谢的活性,并仅适于对合成的蛋白质检测.另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳),即应用两种不同的染料荧光标记两个样品,使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个,避免了几种2-DE的比较,可在纳克级进行检测.

较早期相比,2-DE有两个主要的进步:首先,极高的重复性使有机体的参考图谱,可通过Internet获得,来比较不同组织类型、不同状态的基因表达;其次,高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.