蛋白质结构的测定

    (一)蛋白质一级结构的测定

    蛋白质一级结构的测定又称蛋白质序列分析。其基本方法是：①应用化学裂解法和蛋白酶水解法将多肽链专一性裂解；②逐一测定每个纯化小肽段序列；③根据肽段氨基酸序列中的重叠区确定小肽段的排列次序；④完成整条多肽链的序列分析。

    尽管蛋白质序列分析已经自动化，但仍然耗时、复杂并且昂贵。重组DNA技术出现后，人们可以从cDNA或基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸序列，速度快且经济，已成为最常用的测定蛋白质一级结构的方法。

    (二)蛋白质三维结构测定

    根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类：①应用X线晶体衍射图谱法(X-ray crystallography)和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象(图14-6)；②应用核磁共振法(nuclear magnetic resonance，NMR)、圆二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。

X线晶体衍射的基本原理

    1．X线晶体衍射图谱法

    利用X线晶体衍射图谱法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态构象。而且，很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。另外，X线晶体衍射的工作流程较长。

    2．核磁共振法

    核磁共振是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频(radio frequency，RF)辐射的物理过程。近年来，NMR法测定小型蛋白质的三维结构得到了成功的应用。NMR法不需要制备蛋白质晶体，但这种方法仅限于分析长度不超过150个氨基酸残基的小型蛋白质。

NMR测定蛋白质三维结构的基本过程

    其他方法可以测定溶液中蛋白质分子的局部构象，但很难获得蛋白质分子完整的三结构，在应用上存在较大的局限性。