Electrophoretic Mobility Shift Assay--电泳迁移率检测

凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，已经成为转录因子研究的经典方法。

其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。

生物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程，基因表达调控主要发生在转录水平。近年来，基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机理上，对基因转录调控的研究将是今后相当长一段时期内功能基因组学研究的热点之一。

在转录水平，基因的转录行为是由顺式作用元件（cis-acting elements）和反式作用因子（trans-acting factors）（即转录因子）相互作用调控的，因此要探讨基因的表达调控规律，分离、鉴定基因的位点控制区（loci control region，LCR）中顺式作用元件和相应转录因子至关重要。

但仅仅如此还不够，对于基因表达调控，必须从三个层次展开：一是分离和鉴定基因5＇端核心启动子等顺式作用元件，二是分离和鉴定与各顺式作用元件相对应的转录因子，三是检测各顺式作用元件与对应转录因子的相互作用。鉴定顺式调控元件和转录因子是研究得比较多的内容，而对于顺式作用元件与对应转录因子的相互作用这个层次的研究相对较为薄弱。电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，它正是对第三个层次进行研究的技术之一，核心功能是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白分子。

我们知道，结构基因组学已经很容易实现高通量分析，但在功能研究这个层次上，目前还没有真正高通量的分析技术出现。技术的缺乏是后基因组学时代功能研究的主要瓶颈。和其他功能研究技术一样，电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）本身也存在诸多缺点，比如对于低亲和力结合很难进行鉴定；难以比较不同片断之间亲和力大小的差异；对于蛋白复合体与DNA的结合也无法鉴定。由于体外环境和体内环境存在巨大的差异，电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）很难真正重建体内蛋白质与DNA之间结合过程。对EMSA进行改良或发展更好的研究蛋白质与DNA互作的技术很有必要。

简单说明一下EMSA技术的优缺点，基本原理和实验方法。

Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)

Introduction

Advantage：

can separate different types of complexes, such as monomer and dimer => better than filter binding

easier to see the complex than footprint assay

Disadvantage: do not know where the binding site is.

Rationale

DNA-protein complex will have a smaller mobility than that of free DNA on native gel

gel electrophoresis and molecular sieve

cage effect - difference between footprint and EMSA

Data interpretation

nonspecific binding

smearing between DNA and complex bands

Methods

Lable DNA

Mix DNA and protein to form complex

Add nonspecific competitor

Separate complex with free probe on a native gel

下面是在一个PROTOCAL

1.探针的标记：

（1）如下设置探针标记的反应体系：

待标记探针（1.75pmol/微升）2微升 T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X）1微升 Nuclease-Free Water 5微升 [γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml）1微升 T4 Polynucleotide Kinase （5-10u/微升）1微升 总体积 10微升

按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。

（2）使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

（3）加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

（4）再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

（5）标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

2. 探针的纯化：

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：

（1）对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。

（2）在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

（3）在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

（4）在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

（5）加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。