【申请加分】关于酵母双杂交系统

（一）酵母双杂交系统的基本原理

       酵母双杂交系统的建立与发展是基于对真核生物转录调控起始过程的认识。真核生物中存在一种上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)，其作用是和激活蛋白结合并大大增加启动子的转录速度，从而在转录水平对靶基因表达进行调控。真核细胞转录起始需要反式转录激活因子的参与。

       很多真核生物的位点特异性转录激活因子是组件式的，通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异性结合结构域(DNA-binding domain, BD)与转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。这两个结构域即使分开时仍各具功能，互不影响。

       但一个完整的某个特定基因的转录激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。只有将这两部分通过适当的途径在空间上接近才能恢复其激活转录的能力。不同来源的ＢＤ与ＡＤ结合后则特异地激活ＢＤ结合基因的表达。

       基于这一特性，Fields等设计了一个检测蛋白质与蛋白质相互作用的系统。选择的转录激活因子是酵母细胞中的GAL4蛋白。分离GAL4蛋白N端的1-147个氨基酸（BD）和C端的768-881个氨基酸（AD），分别构建重组质粒。如果在BD上接上一个蛋白X，在AD上接一个蛋白Y，再将这二个质粒共同导入酵母菌中，若X，Y蛋白在酵母内发生交互作用，则相当于将GAL4的BD和AD又连在一起，即可以转录激活下游报告基因的表达，通过测定报告基因的产物及活性来检测这种交互作用的发生（图4）。

       理论上，任何能在酵母中表达的基因均可作为报告基因，较为常用的是LacZ，和一些营养缺陷标记，这种报告基因只允许阳性克隆生长，最常用的是HIS3和LEU2。近来为了更灵敏、特异地筛选阳性克隆,常同时使用两种或两种以上的报告基因(如ADE2和URA3)，一则它可以允许用比单纯颜色筛选更大的菌落密度铺板，从而获得较丰富的表达产物，二则双重筛选相互验证，可以排除一些假阳性结果；三则转化体制造了大量的融合蛋白以保证基因产物满足生长需要，结果LacZ转录提高，从而β-半乳糖苷酶的活性亦增强。

       完整的酵母双杂交系统由三个部分组成：与BD融合的蛋白表达载体、与AD融合的蛋白表达载体、带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。

       双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性,因此可以减少假阳性的出现。

       首先需要构建两种杂合反式作用载体，将蛋白质 A基因与报告基因转录因子的特异BD融合，成为“诱饵”(Bait)；将蛋白质B基因与特异的AD融合为“猎物”（prey）。当编码两种结构域的基因在细胞核内同时表达时，蛋白A与B之间若存在非共价作用，就会使AD与BD两结构域的相互接近，进而激活转录过程，使报告基因得到表达[14][15]。

（二）酵母双杂交系统的特点及优点

       传统的研究蛋白质之间相互作用的方法很多，如交联、修饰、免疫共沉淀和亲合层析等，而且都是采用体外实验来研究蛋白与蛋白间的相互作用。因此在研究中往往受到许多外界实验条件、环境和方法的影响,而且对所研究蛋白的浓度和纯度要求很高,这样就导致了许多假阳性和假阴性实验结果，且无法准确研究蛋白之间微弱的相互作用。

       酵母双杂交系统则是采用体内实验来研究蛋白之间的相互作用，使研究方法发生了革命性的改变，它不受外界影响，方法精确，易于操作。更具特色的是所有操作均是在核酸水平上进行，无需纯化大量的蛋白，并可精确地测定蛋白质之间弱相互作用。

       归纳起来，酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：

1、敏感　双杂交系统的敏感度很高，可检测到蛋白质之间结合常数低至1mmol/L左右的微弱作用。这是因为：融合蛋白在酵母细胞内的高水平表达，不仅仅是由于质粒的高拷贝数，还因为强启动子的控制可以促进融合蛋白的高效表达；AD和BD结合形成转录起始复合物，之后又与启动子DNA结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；转录过程中产生多种稳定的酶使信号放大；检测的结果可以是基因表达产物的累积效应，如酵母表型，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。而体外检测蛋白质相互作用，要经过一系列的洗涤过程，往往降低了信号。

2、简捷　用双杂交系统筛选cDNA文库时，可以简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，只需进行载体构建而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了蛋白抽提纯化等繁琐步骤。

3、高效 酵母转化方法操作简单，转化率高，转化率可稳定在106个转化子/μg DNA以上。酵母菌有很多的营养缺陷型标记，筛选比较方便，能够比较容易地从cDNA文库和基因组文库中直接筛选出蛋白质间的相互作用的阳性克隆。

4、真实　酵母是真核细胞，可以对表达的融合蛋白进行一些基本的修饰(如糖基化和磷酸化等)，表达的蛋白可在细胞核中产生交互作用。融合蛋白之间的作用是在真核细胞内进行，蛋白质经过转录及翻译后修饰，有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，因此所证实的蛋白质间相互作用将更接近体内的真实水平，作用条件与作用力无需模拟。检测在活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。

5、广泛　酵母双杂交系统可采用不同组织器官细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞浆细胞核及膜结合蛋白。以上特点决定了酵母双杂交系统最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用，进而分析其功能。

（三）酵母双杂交系统的应用

     酵母双杂交系统自产生以来，主要应用于下面几个方面：

1、高灵敏度地检测蛋白-蛋白的交互作用
利用双杂交系统可用来检测两个蛋白之间是否存在相互作用，只需将编码两个蛋白的DNA序列分别克隆至双杂交系统的载体中，即可通过检测报告基因是否表达从而论证这两个蛋白是否发生了交互作用。用传统的蛋白检测方法也能验证这种交互作用的发生，但双杂交系统的优点在于它的高灵敏度，而且反映了蛋白在体内的交互作用。如，在Aelst等所做的实验中，用双杂交系统能检测出免疫沉淀法无法检测到的Ras-Raf的交互作用，表明双杂交系统具有非常高的灵敏性，能检测出蛋白间微弱的相互作用

这是因为：①杂合蛋白一般是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白；②双杂交系统能检测出瞬间发生的信号反应，而一般的体外检测法蛋白则要经过一系列洗涤过程，往往导致交互作用不再发生；③融合蛋白的交互作用由于BD和DNA序列的相互结合变得更为稳定；④在转录过程中产生了一些复合酶使信号放大。

2、寻找在蛋白-蛋白交互作用中起关键作用的结构域或活性位点
在证实两个蛋白捅形成交互作用后，可以对该蛋白进行缺失实验，通过缺失掉不同的片段来验证该蛋白在双杂交系统中是否仍具有激活转录的功能，从而对蛋白质中起作用的功能进行精确的定位，进而可以在相互作用的最小区域内进行DNA点突变，改变氨基酸序列，再测定突变体是否仍能激活报告基因的表达，从而找到交互作用的发生所必面的氨基酸残基。

这是双杂交系统的特点所决定的，因为它是在DNA水平上表达蛋白质，只要缺失掉相应的DNA片段即可达到我们的目的，而传统的检测方法则无能为力。另外，通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能，例如Li等在p53和SV40大T抗原的结合实验中，对p53进行突变试验，发现突变型的p53失去了和T抗原结合的能力，这与一些癌症患者的p53蛋白发生的突变是一致的。

3、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白
这是双杂交系统最广泛、最有价值的应用。将感兴趣的目标蛋白基因克隆至BD载体，而将要筛选的cDNA库克隆在AD载体，共同转化酵母宿主菌，如cDNA序列编码的某一段蛋白能和靶蛋白发生交互作用，则启动报告基因的转录，据此可以找到一个新的结合蛋白，使用双杂交系统筛选到的新蛋白已经相当多，并仍在继续扩大，这些蛋白在信号传导方面很可能扮演了重要角色。

例如，由于PKC在细胞的发育和分化中所起的中心作用，Staudinger等将PKC的催化部分克隆到GAL4的BD作为“诱饵”来筛选小鼠T细胞的cDNA库，果然找到了一个新的蛋白PICK1，它和PKC的催化结构域专一性地发生交互作用，并用是PKC磷酸化作用的底物，对PICK1进行深入的研究将会使我们再清楚地了解和PKC有关的信号传导途径。

4、寻找具有药物治疗作用的小分子多肽
用酵母双杂交系统筛选与某种药物设计目标的蛋白分子相互作用的多肽，则筛选到的分子中可能会含有一些具有药物治疗作用的小分子多肽。Yang等证明了一段Leu-X-Cys-X-Glu肽可以与成视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白相互作用，为这项工作打下基础[16]。

5、寻找调控蛋白质相互作用的化合物
确定两个蛋白质A、B具有相互作用以后，在恢复转录活性的双杂交系统中加入第3种物质C，再定量检测报告基因的表达强度，可以确定C对A、B之间相互作用的抑制或增强。Dixx通过APP蛋白重建了Gal4的转录活性，然后加入蛋白酶检测它是否可以切断蛋白，从而阻断Gal4的转录。若此蛋白酶的作用被证实，则还可加入第4种物质，来筛选蛋白酶的抑制剂。

6、绘制蛋白质相互作用图谱
随着基因组及后基因组计划的研究与发展，及各种mRNA在不同组织器官与生长发育不同阶段的分布（时空分布）图谱的构建，蛋白质相互作用图谱的绘制业已展开。在双杂交的AD与BD质粒中同时连入cDNA文库，进行库-库筛选，结合基因微点阵与生物信息学技术，则可以绘制出网状的蛋白联系图谱。

（四）酵母双杂交系统的缺陷

       尽管已证实为一种非常有效的方法，双杂交系统也有自身的一些问题和缺点：
1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。所分析的融合蛋白必须定位于核内，才能激活报告基因，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。但是很多蛋白质的相互作用依赖于翻译后加工，如二硫键的形成等，而此过程非要在胞浆内完成，这样有多种不能被转运到细胞核内的蛋白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白不适用此方法。

虽然目前已在表达载体中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质，尤其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而影响筛选结果。

2、假阳性较多。在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型：I型，表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录；II型，表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录；III，表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激活转录。

这其中部分假阳性来源于筛选对象具有类似转录因子的功能，或在双杂交体系中能表现出这种特性。部分假阳性原因不清，可能与宿主酵母细胞中其他蛋白质的作用有关。

3、在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表达；为抑制背景表达而在培养基中加入的3-AT (3-Amino Triazole)等物质也对菌株有一定的毒性，使得一些较弱的蛋白质间的相互作用呈现出假阴性结果。

4、还应意识到的一点是，虽然双杂交系统可筛选出大量相互作用的蛋白，但其中部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长发育的不同时期，生理状态下是不可能发生相互作用的。因此，对于筛选对象和范围，应有一个合适的选择。

（五）酵母双杂交系统的改进

       在双杂交的具体操作中，虽然筛选本身较为简单，但由于该体系自身的一些特点，使得筛选的结果往往会出现几十、几百甚至更多的阳性克隆，后续的分类、鉴别工作直至找到有意义的基因片段需耗费大量时间和精力。近年来，双杂交系统的广泛应用促进了该系统的不断改进与提高。主要体现在：

1、针对“假阳性”问题出现了多重筛选机制和假阳性显示分析法等。其中多重筛选是指蛋白质相互作用激活两个以上报道基因，只有同时具有两种以上相应表型才是真阳性结果。如Gibcobr1的酵母双杂交系统采用MaV203菌株,该系统共有3个报告基因：HIS3、LacZ和URA3。当Prey-bait相互作用时,以上报告基因表达,酵母可在His缺陷培养平板上生长，使X-gal变蓝，同时由于启动了URA3系统，将培养其中5FOA转化为5FU，使阳性菌落生长受抑制[17]。

位于报告基因上游的启动子是决定报告基因表达灵敏性和特异性最重要的因素，较早的双杂交系统虽然采用了双重报告基因，如HIS3，LacZ，但它们是受同一启动子GAL1的调控具有相同的17个碱基的BD识别序列，能激活其中之一者很有可能在另一检测中亦呈阳性。故目前设计的酵母菌株往往具有不同启动子调控下的报告基因。

如PJ69-A具有三个报告基因：GAL1-HIS3、GAL2-ADE2和GAL7-LacZ，GAL1、GAL2、GAL7都有可被GAL4BD识别的特异序列，且彼此之间各不相同，使三种报告基因能同时产生假阳性反应的几率明显下降。其中GAL2-ADE2，经对照实验检测为一种灵敏性、特异性均强的报告基因，对清除假阳性很有效。多重选择明显提高了筛选率。此外，还可以辅助以抗生素筛选与蓝白筛选相结合的方法。

另外，通过利用酵母着丝粒载体(它在细胞中含有较低的拷贝数)及利用缺失的启动子(如ADH1)来降低两个杂交蛋白的表达水平，来降低假阳性的发生。

2、假阴性。针对一些蛋白可能存在毒性,选用更加灵敏的报告基因，如采用LexA酵母双杂交系统，用LexA取代GAL4的BD，单纯疱疹病毒的VP编码区88个氨基酸取代了GAL4的AD区段。其AD与BD源于原核生物，在真核生物内缺少同源性,因此可以减少假阳性的出现。

3、表达型载体的构建也进行了多方面的改进。首先，融合蛋白被置于一些可被诱导的启动子调控之下，使蛋白质在酵母的表达量能依需要量进行调控。

其次，BD或 AD与作用蛋白质的连接方式也不再只是BD或AD的C端与蛋白质的N端，因为蛋白质的N端和其活性也有很大关系，对于常规连接找不到作用蛋白的对象，改用N端也许能有不同的发现。双杂交体系中不同载体原来均采用氨苄抗性为选择标志，现在可被改进成具有耐氨苄、卡那霉素或氯霉素等不同耐药基因的载体，使得原来很繁琐的从酵母中提取出单一质粒的工作变得快捷。

4、筛选文库的改进。用于双杂交筛选的文库不但应有代表每一基因的足够丰富的多样性，而且由于蛋白质间发生作用的位点可能为蛋白质多肽链的任意位置，所以对每一基因而言，还应当提供尽可能多地与AD连接的位点。

插入片段不宜过大，否则因非特异结合所导致的假阳性也会明显增多。选用更适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的文库是综合提高双杂交技术的一个重要方面。为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库[18]。

它主要有以下特点：(1)来源于多种组织器官和细胞系；因此含有几乎所有基因的cDNA ；(2)所含各种cDNA的丰度趋于平衡；(3)含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多。

5、在能够再增殖的条件下，引入酵母交配策略来筛选大量的不同诱饵蛋白。Fromont-Racine等采用相互作用结合技术（interaction mating strategy），将BD-诱饵蛋白质（X）与AD-基因组文库（Y）分别转化两种不同交配型的单倍体酵母菌株，在滤膜上结合后，涂布于选择性培养基上，挑选出阳性克隆作为诱饵蛋白进行第二轮筛选。该方法省去了利用二倍体菌株筛选中繁琐的交叉影印及大量培养，显著地提高了效率。

6、再次鉴别蛋白质在体内相互作用的步骤更易实施，有报道将双杂交筛出的基因片段插入一个带有抗原决定簇标记的质粒载体，该载体可在哺乳动物细胞中高水平表达被抗原决定簇所标记的蛋白质。用BD-X质粒和带有AD-Y插入的抗原决定簇质粒载体共转染哺乳动物细胞，即可直接进行免疫共沉淀检测。应用这一方法已证实了Bcl-XL和Bad/Bax之间的相互作用。

7、哺乳动物细胞双杂交系统也发展起来。它是利用体内重建转录因子的原理，在基因水平上分析蛋白质-蛋白质相互作用，已成为酵母双杂交系统的辅助手段。该系统与酵母双杂交系统的区别在于报告基因与融合基因位于不同的载体，融合蛋白使报告蛋白水平升高，而不是从无到有。哺乳动物细胞有一个更类似于生理环境的蛋白合成、加工及反应体系，有利于发现起初的蛋白质间相互作用。

该体系除了构建表达载体以外，还需要构建一个可被调控的报告基因载体共同转染细胞。氯霉素乙酰基转移酶（Chlorampheniol acetyltrasferase）活力测定检测，细胞表面标记分子CD4和Hygromycin抗性均可作为报告基因来反映蛋白质间相互作用的有无与强弱。它的优点是哺乳动物更好地模拟细胞内环境，较酵母双杂交更为快速，在转染48h内就可得到结果。

8、核外双杂交系统。由于许多待研究的蛋白质是膜蛋白（如受体蛋白），需定位到膜上才能表现正常的生物功能，且真核细胞蛋白质的成熟还要经过正常的细胞核内部不可能发生的翻译后加工修饰如二硫键的形成，糖基化、聚异戊二烯基化等，传统的酵母双杂交系统已不太适用。

针对这一情况，Aronheim等人对酵母双杂交系统做了重大改进，将蛋白质间相互作用的场所从核内转移到酵母细胞膜上进行，构建了SOS救活系统（SOS recruitment system, SRS）。酵母细胞的一种温度敏感株由于缺乏鸟苷酸交换因子cdc25-2，而不能将外来信号传递给膜上的Ras蛋白，致使该酵母突变体在36℃不能存活。如果人为引入正常的SOS蛋白，并且使SOS与Ras足够接近，则可弥补这一缺陷。

为此，Aronheim等人将SOS蛋白与蛋白质X融合，将蛋白质Y与豆蔻酰基化信号相连，使Y定位于膜上。这样，若X与Y结合，SOS蛋白就会定位于膜上，靠近膜上的Ras蛋白，激活Ras 途径，从而得以在36℃生长。这一系统的提出大大扩展了经典杂合系统的探索领域，而且冲破了许多局限[19]。但是，SRS中也存在一些技术上的问题，如存在可能造成假阳性的Ras家族成员以及类Cdc25蛋白等。

为克服SRS的某些局限，Aronheim等人发展了更为优越的Ras救活系统（Ras recruitment system, RRS）。RRS的理论基础是Ras必须定位到浆膜上才能发挥作用。这种定位是由farnesyl部分结合到Ras C端的一致序列CAAX盒来完成的。在酵母温度敏感株cdc25-2，由于缺乏鸟苷酸交换因子而在36℃不能存活，缺乏CAAX盒的哺乳动物Ras在酵母菌株cdc25-2并不能激活腺苷酸环化酶通路。

以此为基础，将蛋白质X与胞浆突变的哺乳动物Ras融合（诱饵），将蛋白质Y与膜定位信号如豆蔻酰基化序列相融合（猎物），如果X与Y结合，则突变Ras被定位于膜上而发挥作用，使酵母菌株cdc25-2得以在36℃生长[20]。

（六）酵母双杂交系统的拓展

       国外学者为了拓宽传统的酵母双杂交的应用范围，在完善该系统的同时，创立了许多基于双杂交原理的新系统。目前应用较为成功的主要有：单杂交系统(One-hybrid system)、三杂交系统(Three-hybrid system)和逆向双杂交系统(Reverse two hybrid system)。

1、酵母单杂交系统 主要用于研究蛋白质与ＤＮＡ间的相互作用。与双杂交不同之处在于与AD相融合的蛋白质Y直接与DNA结合位点相结合，使AD直接激活下游报告基因的表达，这一过程无需BD-X的参与，故对AD-Y文库的筛选可分离出与靶DNA序列直接作用的蛋白质，为转录因子的分离鉴定提供了有效的实验手段。

2、酵母三杂交系统[21] 研究两个蛋白质与第三个成分间的相互作用，按照第三个成分的不同，可以是蛋白质ＲＮＡ或小分子药物，如果是蛋白则与双杂交的候选条件相同，如果是RNA，则需构建成可以转录成待研究RNA的质粒；如果是小分子药物，可以用化学方法进行修饰。然后使这三种成分相互作用，通过观察下游报告基因的转录情况，判断这三者间是否存在相互作用。

在三杂交体系中，杂交RNA分子可能不是生理结构，在体内共存于同一杂交RNA中，而且RNA只要形成部分正常结构，就可以介导转录激活作用。根据研究成分的不同三杂交系统可分为：蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、小配体三杂交系统和RNA杂交系统。三杂交系统在调控机理研究、疾病防治等方面有广泛应用，还有可能在此基础上发展四杂交系统研究RNA之间相互作用。

3、反向双杂交体系[22] 确定蛋白质之间相互作用后，还要进一步研究其结构和功能的关系，确定蛋白质间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸，特定结构尤为重要。反向双杂交体系的核心在于构建一种反向筛选的报告基因，即蛋白质间特异相互作用所激活的报告基因表达能阻碍转化体生长，从而发挥蛋白质间解离的选择环境。

Vidal以毒性标志URA3为报告基因，BD-X和AD-Y的相互作用使毒性标志基因表达。这是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，其关键是报告基因的表达产物对细胞生长有抑制作用。这样当DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用时，表达出有毒性的报道蛋白，对野生型酶母产生毒性或致死性作用，细胞不能生长。而处于解离状态的BD-X和AD-Y的作用有助于酵母菌的生长。

URA3的表达由含CAL4结合位点的启动子严密控制，此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中需GAL4的DNA结合结构域和转录激活结构域的融合蛋白相互作用，使URA3表达，其产物为合成尿嘧啶所必需，因此细胞能够存活。但此产物同时能催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为毒性产物5-氟尿嘧啶，因此在含有5-FOA 的培养基中BD-X和AD-Y具有相互作用的酵母菌不能生长，发生了蛋白质相互作用解离的菌株才能因表现出抗性而生存。

根据这一原理，应用反向双杂交系统不仅能用于选择相互作用缺陷型的等位基因（即阻断蛋白质相互作用的突变体），还可用于鉴定抑制蛋白质相互作用的小分子。反向酵母双杂交系统还可作为研究体内功能的遗传学方法。临床上可以筛选阻断蛋白质相互作用的小肽类药物，这也是当前及今后研究的热点之一。

酵母双杂交技术问世至今，已发展成为一种广为应用的鉴定分子相互作用的方法，并仍具有很大的发展潜力。这种技术及其拓展技术，必将在研究蛋白质功能、转录调节、基因功能定位和信号转导等领域发挥重要作用，促使我们更深入地理解细胞的活动和功能。