蛋白质胶内酶解

从二维凝胶电泳到基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI―TOF―MS)需要有一个胶后处理系统，包括凝胶的图像扫描和分析、蛋白质斑点切割、酶解和MALDI靶上点样等步骤，其自动化程度的高低是蛋白质组研究能否达到高通量、高灵敏度和高准确性的关键步骤之一。

快速银染的蛋白质点进行胶上酶解的主要步骤如下：

1. 清洗和脱色：将蛋白质点用切胶仪切胶，置于96孔板中。在含有胶粒的每个孔中加入200/A1脱色液(100mmol/L硫代硫酸钠和30mmol/L铁氰化钾溶液按照1：1混合而成)，静置30min后，弃去上清液。然后加200/ul水清洗，静置30min后弃上清液。重复该步骤直至胶粒变为五色。

2. 脱水干燥：在胶粒中加入200ul乙腈静置30min后，弃上清液。重复该步骤至凝皎完全脱水变白。将乙腈吸出舍弃后，将胶粒置于37℃至完全干燥。

3. 酶液泡胀：测序级的胰蛋白酶用20mmol/L碳酸氢铵溶液配制为浓度12.5ng/ml后，加入适量酶液于胶粒中，并于4~C放置30rain使胶粒完全泡涨。然后吸出多余的酶液弃去，以防止质谱检测时出现过多的胰蛋白酶自身降解的肽段。

4. 酶解 ：加约5ul的25mmol/L碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，以防止溶液在酶解过程中干涸。置于37℃控温箱内保温12～16h。

5. 提取：酶解后的胶粒用60u1的0.1%TFA和50%乙腈提取3次，每次20min，合并提取液。

6. 浓缩：在氮气流中将溶液吹干，然后进行MALDI―TOF―TOF―MS鉴定。