酶标记免疫电镜技术
一、简介
病毒是极微小的生物体，用电镜观察时，由于其变形、损伤或杂质的存在，以及标本中病毒的数量有限，只靠其形态特点较难确切辨认。为了提高辨认的准确性，可应用特异性抗体，使其与病毒结合，在电镜下可清晰地辨认特异性抗体及其结合的病毒。这种将免疫学检测方法应用于电镜检查的技术就是免疫电镜技术 (Immunoelectromicroscope, IEM) 。
目前免疫电镜主要分为有标记物和无标记物两大类。无标记物类常用方法为抗原抗体直接作用后形成的免疫复合物的电镜观察。有标记物类，常用在电镜下可见的标记物标记抗体（或抗原），使标记抗体（或抗原）具有原标记物和抗体（或抗原）的特性，然后用标记抗体（或抗原）与相应的组织或培养细胞内特异抗体（或抗原）作用，形成不溶性免疫复合物，即在电镜下可见的标记物，以间接证实免疫反应的发生。常用的标记物有：铁蛋白、辣根过氧化物酶、胶体金等。
二、操作方法
酶标记免疫电镜技术
三、原理
该技术是以酶为抗原—抗体反应的标记物，在不改变抗原抗体的免疫反应特异性，亦不降低酶活性条件下，与相应底物作用后形成不溶性的反应物。在电镜下形成为电子散射力强的终末产物。用于免疫电镜标记的酶有辣根过氧化物酶 (HRP)碱性磷酸酶 (AKP 或 ALP)葡萄糖氧化酶(GOP) 等。目前常用的是 HRP 。
四、材料与仪器
酶标抗体
电子显微镜
五、步骤
（一）在酶标记免疫电镜检查中较常碰到的非特异性染色及其清除方法：
1. 基底染色：某些组织、细胞常带正电荷，而抗体分子则带负电荷。由于静电吸引作用，在组织和细胞中会出现非特异性抗原所在部位的抗原抗体复合物，造成非特异性染色，称为基底染色。最易造成基底染色的有胶原纤维、结缔组织和变性坏死的细胞等。
防止出现基底染色的方法是在用第一抗体孵育前，先用20%制备第二抗体的同种动物正常血清或2%牛血清白蛋白溶液对待检的组织或细胞孵育30 min。这样可明显地减少基底染色。用于封闭非特异性吸附的血清必须无溶血现象，否则，红细胞内的血红蛋白等可与过氧化物酶的底物发生显色反应而出现假阳性。此外，若所用的抗体纯度较低、浓度偏低、每步操作后洗涤不足、加底物溶液后反应时间过长等都可导致或加深基底染色。
2. 内源性过氧化物酶：最常因内源性过氧化物酶而引起假阳性检查结果的是血红蛋白。此外，中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞等都含有过氧化物酶，亦可造成检查结果假阳性。于检查前除去细胞中过氧化物酶类的方法是：①用 1%H2O2 处理待检标本 30 min ②用新鲜配制的 0.5%过氧化氢甲醇溶液处理15分钟；③用 0.01%过碳酸溶液处理 10 min, 再加 0.01% 绷氢化钠水溶液处理 10分钟，以除去过碳酸产生的醛类；④在二氨基联苯胺底物－过氧化氢溶液中加入叠氮钠 (NaN3) 溶液，最终浓度为 0.005mol/L 。
3. 内源性生物素：在组织标本中可存在生物素，做生物素－亲合素免疫染色时，可产生非特异性染色。解决的办法是于检查前先用 2-甲基-D-甘露糖背钝化组织中的生物素，使它们失去生物学活性。
（二）酶标免疫染色特异性对照观察
如同其他实验室检查项目一样，为了提高免疫透射电镜检查的特异性和准确性，必须作一些检查对照。
1. 阴性对照： ①检抗原或抗体的阴性对照：用肯定不含待检抗原或抗体的组织、细胞等标本进行免疫透射电镜检查，结果必须阴性；②无任何抗体的阴性对照：在整个免疫透射电镜的检查操作中，不加入任何抗体，结果应为阴性。若仍为阳性，则多因非特异性吸附、存在内源过氧化物酶或生物素所致；③同种动物正常血清的阴性对照：在免疫透射电镜检查操作中，用制备抗体的同种动物正常血清代替抗体，结果应为阴性。
2. 阳性对照：在免疫透射电镜检查操作中，加人待检的特异性抗原或抗体，结果必须阳性。
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六、注意事项
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