荧光素标记抗体
一、简介
免疫荧光试验 (immunofluorescence assay, IFA)是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，既有免疫学反应的特异性和敏感性，又有显微镜技术精确性和直观性的优点。该方法在病毒学领域应用广泛，可用于细胞培养病毒的鉴定、临床标本中病毒抗原的检测、病毒性疾病的诊断、病毒和病毒抗原在组织细胞内的定位等。
二、操作方法
荧光素标记抗体
三、原理
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四、材料与仪器
荧光色素
抗体
五、步骤
荧光标记抗体方法有直接标记法和间接标记法两种。
(1) 直接法：较为常用，具体步骤是：
1) 抗体溶液的制备：用 0.01mol/L pH 7.1 PBS 将待标记抗体稀释至 20mg/ml;
2) 荧光素：根据待标记抗体的总量，按 0.01mg 荧光素/mg 蛋白，将荧光素溶解于 0.5mol/L pH 9.5 碳酸盐溶液中，体积为抗体溶液的 1/10;
3) 标记：于4℃条件下，抗体溶液放置在磁力搅拌机上，将荧光素逐滴缓慢加入，同时保持反应液pH 值在8.5左右，如此连续搅拌反应 4～6h。应尽量避免产生泡沫，避免将荧光素粘在容器壁及搅拌棒上；
4) 透析：标记后的抗体溶液 2500r/min 离心 20min, 取上清在 10～50 倍体积的 pH 8.0 PBS中透析2～4h;
5) 标记抗体的纯化： Sephadex G-50 凝胶过滤去除游离荧光素。本法标记均匀，重复性好，极少产生非特异性荧光，蛋白质也少变性，荧光亮度好，保存时间长。
(2) 间接法：
1) 抗体溶液的制备：用 0.025mol/L pH 9.5 PBS将待标记抗体稀释至10mg/ml, 装入透析袋中；
2) 荧光素溶液的配制：根据待标记抗体的总量，按 0.05mg 荧光素/mg蛋白称取荧光素，溶解于0.025mol/L pH 9.5 碳酸盐溶液中，体积是抗体溶液的 10 倍；
3) 标记：将透析袋浸泡于荧光素溶液中， 4℃磁力搅拌 16～18h;
4) 标记抗体的纯化： Sephadex G-50 凝胶过滤去除游离荧光素。
六、注意事项
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七、常见问题
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