荧光抗体的制备

四、材料与仪器

荧光色素
抗体

五、步骤

荧光色素的选择 可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素 (fluorochrome) 。目前常用的荧光色素有以下几种：

(1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC): 在碱性条件下， FITC 的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个 Ig分子上最多能标记 15-20个FITC 分子。

(2) 四乙基罗丹明 (tetraethylrhodamine B200, RB200) :不能直接与蛋白质结合，需在五氯磷 (PCl5) 作用下转变成磺酰氯 (S02Cl, 在碱性条件下与蛋白质的氨基反应结合而标记在蛋白分子上。荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与 FITC 标记抗体作双标记或对比染色。

(3) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC): 与蛋白质结合方式同 FITC。它可用于双标记示踪研究。

(4) 其他荧光素：如藻红蛋白 (phycoerythrin, PE) 、蓝色荧光素 7-氨基 -4 甲基香豆素(7-amino-4-methy lcoumarin, AMC入得克萨斯红 (texas red) 等。

用于免疫动物的病毒抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗原物质，最常用的免疫动物是家兔、山羊和绵羊。用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，在免疫荧光技术中主要是提纯IgG, 其提纯方法有饱和硫酸按盐析法、分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤）以及离子交换层析法等，也可将盐析法和层析法结合起来，先用盐析法粗提，然后再经过层析柱进一步纯化。

六、注意事项