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微生物学

荧光抗体染色

2024-04-20 微生物学 加入收藏
一、简介免疫荧光试验 (immunofluorescence assay, IFA)是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术,既有免疫学反应的

一、简介

免疫荧光试验 (immunofluorescence assay, IFA)是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术,既有免疫学反应的特异性和敏感性,又有显微镜技术精确性和直观性的优点。该方法在病毒学领域应用广泛,可用于细胞培养病毒的鉴定、临床标本中病毒抗原的检测、病毒性疾病的诊断、病毒和病毒抗原在组织细胞内的定位等。






二、操作方法

荧光抗体染色

三、原理

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四、材料与仪器

细胞小玻片标本
荧光抗体


五、步骤

荧光抗体染色按不同反应机制,可有以下几种:


1.直接法 用已知特异性病毒抗体与荧光素结合,制成荧光特异性抗体,直接与细胞或组织中相应病毒抗原结合,在荧光显微镜下即可见病毒或病毒抗原存在部位呈现特异性荧光。此法特异简便,但一种荧光抗体只能检查一种抗原,特异度较高,敏感性较差。


具体方法如下:①染色:将(一)中制成的病毒染色标本,滴加染色效价为1:8 或 1:16 的荧光抗体,室温或 37℃湿盒内放置 30min;


②洗片:倾去存留的荧光抗体,将切片浸入 pH 7.4 或 7.2 的 PBS 中洗 2次,每次 5min, 再用蒸馏水洗 1min


③用 50% 甘油 (0.5mol/L pH 9.5 碳酸缓冲液稀释)封固,镜检。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“十”表示:(-)无荧光;(士)极弱的可疑荧光;(十)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++~++++)荧光亮度最强。待检标本特异性荧光染色强度达"++"以上,而各种对照显示为(士)或(一),即可判定为阳性。


2 间接法 利用间接法可检测未知抗原或未知抗体。先用已知未标记病毒抗体(第一抗体)加在含未知抗原的标本上,或用未知未标记抗体(第一抗体)加在已知的病毒抗原标本上,抗原抗体结合后,除去未结合抗原和抗体,再加人荧光抗体(荧光素标记的第二抗体,即如果第一抗体来自人血清,那么第二抗体就是用人类免疫球蛋白 IgG 免疫兔子或山羊获得的抗 IgG 抗体,然后用荧光素标记的第二抗体),荧光抗体与第一抗体结合,形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物,而间接地显示出组织和细胞中抗原或抗体的存在。优点是可用以鉴定未知抗原或抗体,用一种标记的第二抗体,能检测各种抗原抗体复合物,敏感性高。缺点是参加反应的组分较多,受干扰的机会也多,方法较繁琐,费时,需要设置较多的对照。


具体方法如下: ①将(一)中制成的病毒染色标本,置于染色湿盒内;


②滴加 0.01mol/L,pH7.4 的PBS于已知抗原标本片,10 min后弃去,使标本片保持一定湿度;


③滴加未标记的特异性抗体于标本片,37℃作用 30min;


④0. 01mol/L pH 7.2 PBS 洗2次,每次5min,吹干;


⑤滴加特异性荧光抗体于标本片,37℃作用 30min;


⑥如④水洗;


⑦缓冲甘油封固,镜检。


3. 补体法 在抗原抗体反应时加入补体,再用荧光标记的抗补体抗体(如抗C3) 与补体结合形成抗原-抗体-补体-抗补体复合物,在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处。此法敏感性高,仅需一种荧光标记的抗补体抗体,即可检测所有能结合补体的抗原抗体系统。缺点是容易出现非特异性着色,此外补体不稳定,每次均需采取新鲜血清,操作较繁琐。


具体方法如下: ①吸取经适当稀释的免疫血清和补体的等量混合液滴在(一)中制成的病毒染色标本,31℃湿盒内放置 30min;


②用 0.01 mol/L pH 7.2 PBS 洗2次,搅拌,每次 5min, 吸干标本周围水液;


③滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体,37℃放置 30min


④同②洗涤;


⑤蒸馏水洗1 min, 缓冲甘油封固,镜检。


六、注意事项

(一)对荧光抗体的稀释度应适当,过浓易出现非特异性染色,过稀会降低特异荧光亮度,甚至出现假阴性。


(二)已知抗原标本片需在操作的各个步骤中始终保持湿润,避免干燥。


(三)所滴加的待检抗体标本或荧光标记物,应始终保持在已知抗原标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。


(四)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般 30 min 已足够。


(五)封片时应防止产生气泡。


(六)荧光染色后一般在1h 内完成观察或于 4℃保存 4 h,时间过长会使荧光减弱。


(七)为排除非特异性荧光,试验时必须设置以下对照:


1. 直接法: (1) 标本自发荧光对照:标本只加入 PBS 应无自发荧光; (2) 阻断试验:标本先加未标记特异性抗体,再加标记荧光抗体,结果应为阴性; (3) 阳性对照:用已知阳性抗原作荧光染色,应呈阳性。


2. 间接法 心标本自发荧光对照;(1)荧光抗体对照:标本只加荧光抗体染色,结果应为阴性;(2)阻断试验:先加第一抗体,再加未标记的第二抗体,最后加标记的第二抗体,结果应为阴性;(3)阳性对照:用已知特异性抗体与相应抗原结合,再加荧光抗体,结果应为阳性;(4)阴性对照:用已知阴性材料代替第一抗体,经荧光染色后应为阴性。以上结果完全正确,正式实验才能确定结果。此后每批实验都设阴性和阳性对照,以确保实验的准确性。


3. 补体法:除设有阴性、阳性对照外,还应设不加补体的对照,不加抗血清的对照。


七、常见问题

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