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微生物学

固定抗血清-稀释病毒法

2024-04-20 微生物学 加入收藏
一、简介中和试验 (neutralization test)是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物,使病毒与抗体相互反应,再将混合物接种到敏感的宿主体内

一、简介


中和试验 (neutralization test)是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物,使病毒与抗体相互反应,再将混合物接种到敏感的宿主体内,然后测定残存的病毒感染力的一种方法。凡是能与病毒结合,并使其失去感染力的抗体称为中和抗体。因为病毒要依赖于活的宿主系统复制增殖,因此,中和试验必须在敏感的动物体内(包括鸡胚)和细胞培养中进行。中和试验的优点是敏感性和特异性高,中和抗体在体内存在时间长,大多数病毒的中和抗体与免疫力有直接关系。中和试验的缺点是要使用活的宿主系统,病毒对宿主系统产生作用需要一定的时间,因而出结果慢。


中和试验的应用很广泛,主要应用于以下几个方面:①鉴定病毒;②分析病毒抗原的性质;③测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果;④测定病人血清中的抗体,用于诊断病毒性疾病。


二、操作方法

固定抗血清-稀释病毒法

三、原理

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四、材料与仪器

已知标准的抗病毒血清 (20抗体单位 0. 1 ml)
已知阴性血清 (56℃ 30 min 灭活) 宿主:敏感细胞、敏感动物、鸡胚
细胞培养板 水浴锅 细胞培养箱

五、步骤

(以细胞培养为例):①用细胞维持液连续 10倍稀释病毒分离物10-1~10-8);


②取 0. 6ml不同浓度的病毒稀释液与 0. 6 ml 标准的抗病毒血清混合;


③再取 0.6ml 不同浓度的病毒稀释液与 0. 6 ml 已知的阴性血清混合;


④将混合液置 37℃ 水浴1h, 然后取 0. 2 ml 混合液分别接种于细胞已长成单层的 96孔细胞培养板中,每一稀释度接种 5孔,设 5 孔正常细胞对照;


⑤将细胞培养板置 37℃ 、 5% CO2 温箱中孵育,每日观察细胞病变效应 (CPE) 。


⑥中和试验的病毒 CCID50 的计算:细胞培养中,通常是以病毒的组织半数感染量 (CCID50/单位体积)作为中和反应的终点。而动物试验中,用动物半数致死量 (LD50/单位体积)作为中和反应的终点。中和试验中,抗血清组的 CCID50 与阴性血清组的 CCID50 之差的对数等于或大于2, 才能说明中和试验结果为阳性。


六、注意事项

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七、常见问题

用中和试验方法鉴定病毒时,将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清 (20个抗体单位/单位体积)混合、孵育,使二者充分反应,然后将混合液接种到敏感宿主体内,观察试验结果。


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