固定病毒－稀释抗血清法
一、简介
中和试验 (neutralization test)是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体。因为病毒要依赖于活的宿主系统复制增殖，因此，中和试验必须在敏感的动物体内（包括鸡胚）和细胞培养中进行。中和试验的优点是敏感性和特异性高，中和抗体在体内存在时间长，大多数病毒的中和抗体与免疫力有直接关系。中和试验的缺点是要使用活的宿主系统，病毒对宿主系统产生作用需要一定的时间，因而出结果慢。
中和试验的应用很广泛，主要应用于以下几个方面：①鉴定病毒；②分析病毒抗原的性质；③测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；④测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。
二、操作方法
固定病毒－稀释抗血清法
三、原理
病毒的复制需要宿主细胞供应原料、能量和复制场所，因此病毒必须在活的细胞内复制增殖。病毒进入机体后，吸附于敏感细胞的表面，然后通过穿入、脱壳、侵入细胞，进行病毒复制和装配，并引起机体感染。特异性的抗病毒抗体（中和抗体）与病毒结合之后，使病毒失去吸附、穿入宿主细胞的能力，从而阻止了病毒在宿主细胞内的复制和病毒感染机体的过程。
进行中和试验时，首先将病毒与抗体在适当的条件下混合、孵育后，接种给敏感宿主，然后要观察病毒感染敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。
用敏感动物进行中和试验时，主要观察抗体能否保护易感动物免于死亡、瘫痪；用细胞培养法进行中和试验时，主要观察抗体能否抑制病毒的细胞病变效应 （cytopathic effect, CPE） 或病毒空斑形成等；用鸡胚接种法进行中和试验时，主要通过观察绒毛尿囊膜上的痘疮结构来检测病毒或用血凝试验检测鸡胚尿囊液流感病毒的滴度。
四、材料与仪器
器材：96 孔细胞培养板
病毒：具有感染力的病毒（已滴定的标准病毒 100 TCID50 0.1 mL 或 100 LD50 0.1 mL）
试剂：
① 病毒抗体阳性的血清
② 病毒抗体阴性的血清：急性期或恢复期血清（通常 56℃ 30 min 灭活）
③ 敏感宿主体系：敏感细胞、敏感动物、鸡胚
五、步骤
细胞培养为例：
（1） 用细胞维持液连续倍比稀释急性期和恢复期血清；
（2） 取 1.0 mL 不同浓度的稀释血清分别与 1.0 mL 标准病毒 （100 CCID50/0.1 mL） 混合，置 37 ℃ 水浴作用1 h；
（3） 取混合液 0.2 mL 分别加到细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中，每一稀释度接种 4 孔细胞。同时设 4 孔正常细胞对照和设 4 孔 100 CCID50/0.2 mL 作病毒对照；
（4） 设病毒滴度对照。将病毒液连续 10 倍稀释后，加到细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中，每个稀释度接种 4 孔细胞，每孔加 0.1 mL。必要时还要设抗体阳性血清对照和抗体阴性血清对照；
（5） 将 96 孔细胞培养板置 37 ℃、5% CO2 温箱中孵育，每日观察细胞病变效应（CPE）；
（6） 50% 血清中和终点的计算：50% 细胞不产生细胞病变（CPE）的血清稀释度。根据细胞病变程度，用 Reed-Muench 法计算 50% 血清中和终点。
六、注意事项
（1） 病毒悬液：病毒应低温保存，融化后只可使用一次，避免反复冻融，这样会降低病毒的毒力。多次进行同一试验时，应使用同一批冻存的病毒，以减小误差。
（2） 抗血清：人和动物血清中含有一些非特异性的物质，这些物质可增强抗病毒抗体的中和作用，也可以灭活病毒，通常采用加热的方法破坏这些物质。不同来源的血清灭活温度不尽相同，人、豚鼠血清为 56 ℃， 兔为 65 ℃， 时间为 20~30 min。在细胞培养中进行中和试验时，要注意避免使用相同的细胞。
例如，用猴肾细胞培养的病毒免疫动物制备的抗血清，不宜用于以猴肾细胞为敏感宿主的中和试验上，因为该血清中含有抗猴肾细胞的抗体，对猴肾细胞有细胞毒作用或能封闭猴肾细胞，使病毒不能进入细胞内繁殖，从而影响了中和试验的结果。
（3） 孵育的温度和时间：病毒与抗血清在 0 ℃ 时不发生反应，5 ℃ 以上才发生中和反应。通常采用 37 ℃ 孵育 1 h, 一般的病毒即可和抗血清充分反应。但是，一些特殊的病毒在此反应条件下不能充分反应，试验时应根据不同的病毒改变孵育的时间和温度。
七、常见问题
该方法主要用于血清抗体滴度的测量。将 100 CCID50/单位体积的病毒分别与连续倍比稀释的病人急性期或恢复期血清混合孵育 1 h 后，把混合液接种于敏感宿主，然后观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况。
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