穿梭质粒
一、简介
利用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生长，而不能在37°C形成菌落。如果用一个酵母菌基因组文库转化cdc101-1菌株，通过分离温度不敏感菌落，那么就可能分离到一个可以互补这种突变的酵母菌基因。分离到温度不敏感菌落后，必须采取两个步骤来证明在这种转化到cdc101-1菌株中的质粒含有野生型cdc101基因。第一步，假如这种观察到的互补现象是由质粒引起的，而非cdc101-1回复突变造成，互补质粒的分离必定导致质粒所带的选择标志及互补表型同时消失。第二步，必须排除是否被克隆的基因编码了这种突变的表型抑制基因的情形，而非野生型基因编码。这些均可通过互补实验来实现，并且可证明一个整合到基因组中的克隆基因的破坏是否能够互补原有的突变。
二、操作方法
穿梭质粒
三、原理
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四、材料与仪器
缺失成分平板+Ura 含有5-FOA YCp质粒选择性培养基的平板 YPD平板 YIP5载体
培养皿
五、步骤
1) 构建染色体上重要基因被破坏的单倍体菌株以及含有完整重要基因和URA3选择标 记的YEp或YCp质粒。
2) 对于诱发突变，将重要基因亚克隆到带有不同选择标记的YCp载体上， 将大约10〜20μg DNA采用羟胺或其他技术进行诱变。或者将一个重要基因的突变衍生物克隆到YCp载体上。
3) 用乙酸锂法将其转化入第1步中的菌株，利用添加了尿嘧啶的缺失成分平板选择 YCp质粒，在许可温度下进行培养（一般为25℃)。在尿嘧啶存在的情况下，生长周期降低了对YEp质粒的选择性，也就是在每个转化菌落中，一部分细胞已丟失了（携带重要基因非突变拷贝的）质粒。但是应注意任何携带有来自于YCp质粒的未突变基因拷贝的转化子不能失去YEp载体。
4) 将每个转化平板都影印接种到两块含有5-FOA的平板上，同样保持对YCp的选择 性。将一块平板在许可温度下培养，另一块在非许可温度下培养（一般为36℃)。 作为对照，将每个转化平板都影印两个YPD平板并在相同的两个温度下培养。
5) 收集那些在许可温度下产生Ura—乳突而在非许可温度下不产生乳突的菌落（并在YPD培养基平板上在两种温度下都能正常生长），将它们划线接种以产生单菌落。
6) 对每一个候选菌株检验约6个菌落，看它们在两种温度下是否都能产生乳突。
7) 对于每一个在步骤6中已经检验过的温敏突变候选株，通过在保持YCp筛选的平板 上划线的方法，回收在许可温度下5-F0A平板上的Ura—乳突。从这些菌株（现在这些菌株应当只含有YCp质粒）分离质粒，将它们转化到大肠杆菌
8) 将带有温敏突变的基因亚克隆到YIP5质粒中，通过移换技术将这一突变基因引入染色体。
六、注意事项
影印通过检测一部分菌落是否丢失了 Ura+YEp质粒来区分不同种类的转化子，Ura-的细胞表现为5-FOAr,因而从大多数Ura+的菌落背景中呈乳突状生长。携带有来自于YCp质粒的未突变基因拷贝的转化子在两种温度下都会表现出Ura-乳突，而携带有来自于YCp的温度敏感突变的转化子只能在许可温度下才产生Ura_乳突。携带有无效突变基因的转化子在任何温度下都不会产生乳突。
七、常见问题
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