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微生物学

发酵法(乙醇发酵实验)

2024-05-09 微生物学 加入收藏
一、简介在无氧条件下,酵母菌利用己糖发酵生成乙醇和CO2的作用,称为乙醇发酵。生产上所使用的酵母菌原菌一般是固体斜面试管菌种,由于起酵母数量太少,不够生产之需,

一、简介

在无氧条件下,酵母菌利用己糖发酵生成乙醇和CO2的作用,称为乙醇发酵。生产上所使用的酵母菌原菌一般是固体斜面试管菌种,由于起酵母数量太少,不够生产之需,必须将斜面菌种进行若干次的扩大培养,以获得含有足够数量酵母菌的酵母培养物。


 二、操作方法

发酵法(乙醇发酵实验)


 三、原理

在无氧条件下,酵母菌利用己糖发酵生成乙醇和CO2的作用,称为乙醇发酵。目前乙醇发酵所采用的微生物主要是酵母菌。生产上所使用的酵母菌原菌一般是固体斜面试管菌种,由于起酵母数量太少,不够生产之需,所以必须将斜面菌种进行若干次的扩大培养,以获得含有足够数量酵母菌的酵母培养物(通常是液体培养物,也有固体培养物的),以供乙醇发酵以用,故被称为酒母。

材料与仪器

K氏母菌 酵母菌 麦牙 甘薯粉 木薯粉
细菌淀粉酶 琼脂
接种杯 酒精灯 试管 三角瓶 烧杯 水浴锅 恒温培养箱 蒸馏烧瓶 冷凝管 牛角管 容量瓶 量筒 电炉 石棉铁丝网 乙醇 温度计

步骤

一、酵母菌的扩大培养

1. 培养基的制备

酵母扩大培养中的试管和三角瓶培养用的基通常采用麦牙汁,其制备方法如下:将干麦牙磨碎,加入3.5倍量的65 ℃的热水,在58~60 ℃的温度下糖化3~4 h,以碘液检查糖化完全后,将其煮沸、过滤,将滤液浓度调整到13oBx。将上述制备好的麦牙汁进行分装并灭菌。

(1)固体斜面使馆培养基:取100 ML麦牙汁,加入2 %琼脂,融化后分装试管,一般培养基的装量是试管容量的1/5。以121 ℃蒸汽灭菌20min,取出后趁热置成斜面,放冷,斜面的长度为试管长度的1/2~3/5。

(2)液体试管培养基:用稀硫酸将麦牙汁pH调节至4~4.4,分装于试管中,每支试管分装5 ML。以121 oC蒸汽灭菌20 min。

(3)小三角瓶培养基:将pH调节至4~4.4的麦牙汁分装于容量为150ML的三角瓶中,每瓶装50ML,以131oC蒸汽灭菌20 min。

2. 接种与扩大培养

(1)将斜面试管酵母原菌移接于固体斜面试管,于28~30 ℃下培养48 h。

(2)将上述培养好的斜面活化酵母菌种接一环于液体试管中,以28~30 ℃培养24 h。

(3)将上述液体试管酵母接种于小三角瓶中(每支试管接一个三角瓶),以28~30℃培养至对数期末(约16 h)。

3. 种子(酒母)质量要求

对培养好的三角瓶种子要进行质量检查。镜检时要求酵母形态健壮整齐,细胞内原生质稠密,无杂菌,细胞数(0.8~1.0)×10个/ML,出牙率20%~30 %,死亡率要小于1 %。

二、淀粉原料的蒸煮与糖化

1. 按甘薯粉或木薯粉的3.5倍量的加水比,用50~55 ℃的温水与淀粉原料搅拌混合,添加原料量0.1%的细菌淀粉酶,于电炉上加热并不断搅拌,升温至90~93 ℃,5~10 min,进行液化;继续加热煮沸1h,使淀粉充分糊化和液化,并适量补充水分。

2. 将上述蒸煮醪冷却至60~62 ℃,添加180 u/g原料的糖化酶,用硫酸将醪液的pH调节至4~4.5,在水浴锅上保温糖化30 min,而后分装于1000 mL的三角瓶中,每瓶装糖化醪500 mL。

3. 糖化醪的质量要求:糖度15~17 °Bx,还原糖6 %~9 %,Ph4~4.5。

三、糖化醪的发酵

将培养成熟的小三角瓶酵母种子(酒母)以无蓖操作接入装有500 mL糖化醪的大三角瓶中(每个小三角瓶中接一个大三角瓶,在30 ℃的温度下发酵68~72h。

四、CO2生成量的测定

测定乙醇发酵中CO2生成量的装置如图5-1所示。其测定方法如下:

1. 发酵前,将三角瓶外壁擦干,置于1/100g的大平上称重,记下质量为m1

2. 发酵完毕后,将三角瓶轻轻摇动,使CO2尽量逸出。在同一架天平上再称重,记下质量为m2

3. CO2生成量=m1-m2

五、乙醇度的测定

1. 安装好蒸馏装置。

2. 准确量取100 mL发酵成熟醪倒入500 Ml蒸馏瓶中,并加入等量的蒸馏水。蒸馏瓶用插有温度计的胶塞塞紧,连接好冷凝管,勿使漏气。用电炉加热,同时接通冷却气,馏出液收集于100mL容量瓶中(如无容量瓶亦可直接用100 mL量筒收集)。待馏出液达到刻度时,立即停止收集(注意:不能超过刻度),倒入量筒中,稍加搅动,使之均匀,将酒精计与温度计同时置入量筒,测定酒精度与温度。

3. 根据测得的乙醇度与温度,查换算表,得到温度在20 ℃时的乙醇浓度。



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