微生物学

电穿孔转化（酵母转化实验）

2024-05-09 微生物学加入收藏

一、简介转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现

一、简介

转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种，它不同于通过噬菌体感染传递遗传物质的转导以及通过细菌细胞的接触而转移DNA的细菌接合。

二、操作方法

电穿孔转化

三、材料与仪器

酵母

二硫苏糖醇山梨醇
电穿孔仪器电击池水浴锅

步骤

1. 实验前两天，将转化用酵母菌株的单菌落接种于5 ml YPD培养基中，30℃过夜培养至饱和。

2. 转化前一天晚上，在装有500 ml YPD培养基的2 L 无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30℃剧烈摇动培养过夜，直到细胞密度达1×108细胞/ml（OD600≈1.3~1.5，依据菌株不同而异）。

3. 于4℃以4 000 g 离心收获培养细胞，细胞用80 ml 无菌水重悬。为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。如果这种处理并不需要的话，可接步骤6。

4. 加入10 ml 10×TE缓冲液，pH7.5。搖晃混匀，再加入10 ml 10×乙酸锂贮液，旋转摇匀，于30℃轻轻摇动45 min。

5. 加2.5 ml 1 mol/l DTT并同时旋转摇动，于30℃轻轻摇动15 min。

6. 将酵母菌悬液稀释在500 ml 水中、洗涤3次，每次以4 000~6 000 g 于4℃离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：

（1）第一次沉淀：250 ml 冰冷的水

（2）第二次沉淀：20~30 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇

（3）第三次沉淀：0.5 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇

使用Bio-Rad公司的Gene Pusler：

9a. 往一个无菌、冰冷的1.5 ml 微量离心管加入40 μl 浓缩的酵母菌细胞和≤100 ng 待转化的DNA（体枳≤5 μl），混匀。

10a. 将酵母与转化DNA混合物转移到冰冷的0.2 cm 间隙的一次性电击池中。

11a. 以1.5 KV、25 μF、200 Ω 作脉冲转化，电路中应包括Bio-Rad脉冲控制仪，而这十分重要，如果不这样的话，将会损坏Gene Pulser。

12a. 往电击池加入1 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇回收酵母细胞，然后用无菌的巴斯德吸管轻轻吹吸混匀。

13a. 将酵母菌液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30℃培养3~6天，直到平板上出现菌落。

使用Life Technologies 的 Cell-Porator：

9b. 往一支无菌，冰冷的1.5 ml 微量离心管中，加入20 μl 浓缩的酵母菌和待转化的DNA。DNA用量要≤100 ng，体积≤5 μl。

10b. 将酵母菌/DNA混合物转移到0.15 cm 间隙的电转槽中。

11b. 以400 V，10 μF，低电阻下进行脉冲转化。

12b. 取10 μl 电转混合物加到1.5 ml 无菌的微离心管中，其中含有0.5 ml 冰冷的1 mol/l 山梨醇。

13b. 将酵母菌悬液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30℃培养3~6天，直到平板上出现菌落。