RAP－PCR 方法

RAP－PCR 方法，英文名是 RNA arbitrarily primed PCR fingerprinting，是 AP－PCR 不限于基因组指纹分析，用于 RNA 指纹分析的方法。

RAP－PCR 方法的基本原理：

用适当选择的一系列人工随机合成的寡聚核昔酸单链为引物，以所研究的基因组 DNA 或 RNA 反转录产生的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。若引物在模板 DNA 的两条链上有互补位点，且方向正确，距离在一定长度范围内，就可以扩增出 DNA 片段，多个随机引物可以使检测区域扩大至整个基因组。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，EB 染色或放射性自显影得到 DNA 指纹图谱，进而分析比较其多态性。这些扩增 DNA 片段的多态性反映了基因组 DNA 相应区域的多态性。

RAP－PCR 方法可用于病原菌基因分型与检测研究、物种亲缘关系鉴定与研究、昆虫学研究构建遗传连锁图谱研究、克隆特异基因探针方面、动物品系鉴定及遗传监测方面、核心种子资源保存和鉴定方面、鉴定差异表达基因方面等领域的研究。

器材：PCR 仪

试剂：

① 1 mol/L Tris－HCl （pH 8.0）

② 1 mol/L Tris－HCl （pH 8.3）

③ 1 mol/L KCL

④ 1 mol/L MgCl2

⑤ 0.1 g/L 明胶

⑥ 5 mmol/L 各种 dNTP

⑦ 1 mmol/L DTT

⑧ 10 μmol/L 引物

⑨ ［α－32P］dCTP

⑩ 无 RNase 的 DNase I

⑪ MuLVRT

⑫ Tag DNA 聚合酶

RAP－PCR 方法的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

引物：用任意引物 PCR 法进行 RNA 的指纹分析通常需要两种引物，即反转录引物和 PCR 引物。

前者一般采用 oligo (dT) 来起始 cDNA 合成，也有人直接采用任意引物起始第一链 cDNA 的合成。

后者的设计与使用原则与 AP－PCR 法相同。

（二）流程二

模板：

A. 用异硫氰酸胍－氯化铯离心法或异硫氰酸胍－酸酚－氯仿抽提法制备总 RNA 最终的沉淀溶于 100 μl 水中。

B. 加入 100 μl 2× DNase I 处理混合物：20 mmol/L Tris－HCl （pH 8.0），20 mmol/L MgCl2，200 U/ml 无 RNase 的 DNase I，37 °C 温育 30 min。酚－氯仿抽提，乙醇沉淀。

C. 用紫外分光光度计测定 RNA 的浓度。将 RNA 用水稀释为两个浓度，分别大约 20 ng/μl 和 4 ng/μl。

（三）流程三

反转录：

A. 在冰浴中配制反转录反应液，于 10 μl 每种浓度的 RNA 中加入 10 μl 2×第一链反应混合物：100 mmol/L Tris－HCl （pH 8.3），100 mmol/L KCl，8 mmol/L MgCl2，20 mmol/L DTT，0.4 mmol/L 每种 dNTP，4 μmoI/L 反转录引物，2 U/μl MuLVRT。

B. 在热循环仪中 37 ℃ 温育 10 min，然后 94 °C 2 min 灭活反转录酶，最后冷却至 4 °C。

（四）流程四

任意引物 PCR：

A. 在每个 20 μl 的第一链合成反应液中再加入 20 μl 2×第二链反应混合物：20 mmol/L Tris－HCl （pH 8.3），20 mmol/L KCl，8 mmol/L MgCL2，0.4 mmol/L 每种 dNTP，0.1 μCi/μl ［α－32P］dCTP，0.4 U/μl Taq DNA 聚合酶，8 μmol/L 任意引物。

B. 先做一个低严紧性的循环，如 94 °C 1 min、40 °C 5 min、72 °C 5 min，然后再做 35 个高严紧性的循环，如 94 °C 1 min、60 °C 1 min、72 °C 1 min。

（五）流程五

检测：

每个反应液 4 μl 用 18 μl 95％ 甲酰胺稀释，94 °C 加热 2 min，然后取 1.5 μl 加样到 5％ 聚丙烯酰胺－50％ 尿素的测序胶上，用 1×TBE 缓冲液，50 V 电泳 3 h， 干燥凝胶，X 射线胶片放射自显影 12 h。

注意事项：

通常可看到约 50~1000 个碱基的片段。

（1） 模板 DNA 的质量问题

任意引物 PCR 获得的实验结果的可重复性是大家普遍关心的问题，这类问题的大部分原因是由于制备的模板 DNA 质量不合格造成的，检查 DNA 质量是否合格的最简单的方法是在 200ng？200ng 这一范围内对 DNA 作一系列二倍稀释，如果一定浓度的 DNA 稀释物用不同的引物均不能产生可靠的指纹，那么模板的质量便值得怀疑了。

解决这一问题的方法是：①制备较高质量的 DNA 模板，避免污染非靶 DNA 序列；②选择合适的模板 DNA 浓度，每种样品实验开始时至少要用两种浓度的 DNA 模板进行分析。

（2） 引物的选择

不是所有的引物均能使特异产物扩增而得到有意义的结果，所以应进行多个引物尝试，从中选择出较为理想的分析引物，一般情况下应该选择能产生中等复杂度的图谱的引物。

（3）PCR 反应条件

缓冲液成分 （特别是镁离子浓度） 和反应条件都可以对任意引物 PCR 的结果产生影响，每次实验前都应该进行反应成分和条件的优化，并同时设立阴、阳性对照。

（4） 扩增结果中出现的弱带的分析

弱带形成的原因有多种，那些重复性好的弱带可能是因为引物与模板不能完全匹配造成的，这类弱带可以记录，但退火温度提高就会影响这些实验结果的稳定性。那些重复性不好的无规律出现的弱带可能是由非专一扩增、产物间退火或者其它人为因素造成的，不能记录。

（5）RNA 丰度是影响 RAP－PCR 扩增结果的最常见因素解决这个问题，一是提高起始步骤的严紧性，二是采用嵌套式 RAP－PCR，即取第一次 RAP－PCR 的少量样品，在高严紧性条件下，用那些在第一引物序列的 3』端加上一个、两个或三个任意选择核昔酸的第二嵌套式引物做进一步的扩增。