AP－PCR 方法

AP－PCR 方法，英文名是 arbitrarily primed PCR，是由 Williams 和 Welsh 同时在 1990 年建立起来的，由于它具有简便、快速，一套引物可用于多个物种的分析，不需预知被检对象的核酸序列和可以显示差异表达基因等特点，已广泛应用于诸多领域。相信随着任意引物 PCR 技术实验重复性和标准化问题的解决，其应用潜力必将得到进一步的开发，成为分子生物学和分子遗传学研究中重要的和常用的手段之一。

AP－PCR 方法的基本原理：

用适当选择的一系列人工随机合成的寡聚核昔酸单链为引物，以所研究的基因组 DNA 或 RNA 反转录产生的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。若引物在模板 DNA 的两条链上有互补位点，且方向正确，距离在一定长度范围内，就可以扩增出 DNA 片段，多个随机引物可以使检测区域扩大至整个基因组。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，EB 染色或放射性自显影得到 DNA 指纹图谱，进而分析比较其多态性。这些扩增 DNA 片段的多态性反映了基因组 DNA 相应区域的多态性。

AP－PCR 方法可用于病原菌基因分型与检测研究、物种亲缘关系鉴定与研究、昆虫学研究构建遗传连锁图谱研究、克隆特异基因探针方面、动物品系鉴定及遗传监测方面、核心种子资源保存和鉴定方面、鉴定差异表达基因方面等领域的研究。

器材：PCR 仪

试剂：

① 1 mol/L Tris－HCl （pH 8.3）

② 1 mol/L KCL

③ 1 mol/L MgCl2

④ 0.1 g/L 明胶

⑤ 5 mmol/L 各种 dNTP

⑥ 10 μmol/L 引物

⑦ Tag DNA 聚合酶

AP－PCR 方法的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

引物：AP－PCR 引物的序列是随机的，但也不是釆用所有的随机引物都能得到理想的结果，通常需要用大量的引物来尝试。

注意事项：

一般情况下，AP－PCR 引物有两大类：一类是采用较长的引物即 20 个左右碱基的单条或双条引物，另一类是釆用较短的引物即 9~10 个碱基的单条引物。

（二）流程二

模板：模板制备因样品的不同而有所差异，下面以细菌标本为例做一介绍。

A. 取 2~5 ml 过夜培养细菌 4 °C，6000 r/min、10 min 离心收集于微量离心管中，用 500 μl TE （pH 8.0） 悬浮，加入溶菌酶至终浓度为 0.2 mg/ml，37 °C 作用 1 h，加 10％ SDS 60 μl、20 mg/ml 蛋白酶 K 6 μl，37 °C 过夜。

B. 再加入 RNase 至终浓度为 20 μg/ml，55 °C 作用 20 min。用等体积的酚－氯仿－异戊醇和氯仿－异戊醇各抽提 2 次，加 1/10 体积的 3 mol/L 醋酸钠，用冷乙醇沉淀 DNA，DNA 溶于 50 μl 双蒸水中，用紫外分光光度计测定 DNA 的纯度与浓度，并制备成约 25 ng/μl 的 DNA 样品。

（三）流程三

反应体系：

① 10 mmol/L Tris－HCl （pH 8.3）

② 10 mmol/L KCl

③ 5 mmol/L MgCl2

④ 0.1 g/L 明胶

⑤ 100 μmol/L 各种 dNTP

⑥ 0.2～0.4 μmol/L 引物

⑦ 25 ng 基因组 DNA

⑧ 0.5μ Taq DNA 聚合酶

总体积 50 μl。

（四）流程四

反应参数：

A. 通常情况下该反应包括两个反应条件：

第一个为低严紧反应条件，如 94 ℃ 1 min、40 °C 1 min、72 °C 2 min，进行 2~5 个循环。

第二个为高严紧反应条件，如 94 °C 1 min。 60 °C 1 min、72 °C 2 min，共进行 30 个循环。

B. 也可仅设定一个低严紧反应条件进行扩增，如 94 °C 1 min、36 °C 1 min、72 °C 2 min，共进行 40 个循环。

（五）流程五

检测：

A. 取扩增产物在测序聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并在 X 射线片上曝光分析扩增结果。

B. 也可用普通的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色。

（1） 模板 DNA 的质量问题

任意引物 PCR 获得的实验结果的可重复性是大家普遍关心的问题，这类问题的大部分原因是由于制备的模板 DNA 质量不合格造成的，检查 DNA 质量是否合格的最简单的方法是在 200 ng ~ 200 ng 这一范围内对 DNA 作一系列二倍稀释，如果一定浓度的 DNA 稀释物用不同的引物均不能产生可靠的指纹，那么模板的质量便值得怀疑了。

解决这一问题的方法是：①制备较高质量的 DNA 模板，避免污染非靶 DNA 序列；②选择合适的模板 DNA 浓度，每种样品实验开始时至少要用两种浓度的 DNA 模板进行分析。

（2） 引物的选择

不是所有的引物均能使特异产物扩增而得到有意义的结果，所以应进行多个引物尝试，从中选择出较为理想的分析引物，一般情况下应该选择能产生中等复杂度的图谱的引物。

（3）PCR 反应条件

缓冲液成分 （特别是镁离子浓度） 和反应条件都可以对任意引物 PCR 的结果产生影响，每次实验前都应该进行反应成分和条件的优化，并同时设立阴、阳性对照。

（4） 扩增结果中出现的弱带的分析

弱带形成的原因有多种，那些重复性好的弱带可能是因为引物与模板不能完全匹配造成的，这类弱带可以记录，但退火温度提高就会影响这些实验结果的稳定性。那些重复性不好的无规律出现的弱带可能是由非专一扩增、产物间退火或者其它人为因素造成的，不能记录。

（5）RNA 丰度是影响

RAP－PCR 扩增结果的最常见因素解决这个问题，一是提高起始步骤的严紧性，二是采用嵌套式 RAP－PCR，即取第一次 RAP－PCR 的少量样品，在高严紧性条件下，用那些在第一引物序列的 3』端加上一个、两个或三个任意选择核昔酸的第二嵌套式引物做进一步的扩增。