反转录巢式 PCR

反转录巢式 PCR(RT－nested PCR)是在反转录 PCR 的基础上发展起来的，在通过反转录获得 cDNA 的基础上，对目的基因进行巢式 PCR 扩增。它和简单的反转录 PCR －样是用于检测某种 RNA 是否被表达，或者比较其相对表达水平，但是特异性更高、可靠性更强。

反转录巢式 PCR 的常用领域如下：

用于拷贝数较低的 RNA 的扩增，例如扩增丙型肝炎病毒 (HCV) 感染者体内的 HCV 基因。

器材：PCR 扩增仪、电泳仪

试剂：

① 模板： 总 RNA 或 mRNA

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

③ 10 umol/L 四条特异引物： 两条外引物，两条内引物

④ TaqDNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液

⑤ 反转录酶及其 10× 缓冲液

⑥ RNA 酶抑制剂

⑦ 高压灭菌去离子水

反转录巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

在进行反转录合成时，可根据不同需要选择下列引物。

（1）随机引物：适用于长的或具有发卡结构的 RNA， 例如 rRNA、mRNA、tRNA 等，主要用于单一模板的 RT－PCR 反应。

（2）oligo(dT)：适用于具有 poly(A)尾巴的 RNA ［原核生物的 RNA、真核生物的 rRNA 和 tRNA 不具有 poly(A)尾巴丄由于 oligo(dT)要结合 poly(A)尾巴］。所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长 cDNA 合成量大大减少。

（3）基因特异性引物：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

获得 cDNA 模板后，进行巢式 PCR 的引物设计方法同普通的巢式 PCR 一样。

（二）反转录巢式 PCR 反应

A. 反转录反应：

反转录反应可以利用 oligo（dT）15 或随机引物引导。如果需要由 3＇poly（A） 区域引导，选用 oligo（dT）15 引物；如果需要引导全长 RNA， 选用随机引物。当使用 cDNA 进行 克隆及 PCR 反应时，通常选择 oligo（dT）15 引物。如果 cDNA 用于 RT－PCR， 有时随机引物比较 合适，特别当 PCR 引物定位于 RNA5＇末端时更是如此。

将 1 μg RNA ［poly（A）＋mRNA 或总 RNA］ 加入微量离心管中并于 70 °C 温育 10 min， 短暂离心后置于冰上。依照下列所列顺序，加入以下试剂以建立一个 20 叫的反应体系。

（依据 RNA 的量，反应体积可以增减）

MgCl2， 25 mmol/L 4 μl

AMV 反转录酶 （高浓度） 15 U

反转录 10× 缓冲液 2 μl

oligo（dT）15 引物或随机引物 0.5 μg

dNTP 混合物，10 mmol/L 2 μl

RNA 模板 1 μg

重组的 RNasin＠核糖核酸酶抑制剂 0.5 μl

加无核酸酶的水 至 20μI

如果使用 oligo（dT）15 引物，将反应体系于 4 ℃ 温育 15 min。如果使用随机引物，将反应体系于室温温育 10 min， 然后于 42 ℃ 温育 15 min。增加的室温温育步骤有利于引物的伸展，使得当温度升高到 42 ℃ 时引物仍处于杂交状态。

然后将样品于 95 ℃ 加热 5 min， 然后于 0～5 ℃ 放置 5 min。这一步将使 AMV 反转录酶失活并阻止其与 DNA 结合。第一链 cDNA 可用于第二链 cDNA 的合成或 PCR 扩增，也可以将第一链 cDNA 存放于－20 ℃ 备用。

B. 巢式 PCR 反应

设立 50 μl 的 PCR 反应体系，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

cDNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 （P1、P2） 各 1 μl

H2O 至 50 μl

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油 （约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

C. 设置 PCR 反应条件：

预变性 94 ℃，3 min

变性 94 ℃，30 s

退火 55 ℃，30 s 30 个循环

延伸 72 ℃，60 s

延伸 72 ℃，7 min

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

D. 进行第二轮 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

第一轮 PCR 扩增产物 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 （P3、P4） 各 1 μl

H2O 至 50 μl

PCR 反应条件同第一轮，反应中的条件与循环数视具体情况而定。

D. PCR 产物的检测

反应结束后，用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1. 在反转录反应中，可以用特异性下游引物 （由使用者提供） 代替 oligo(dT)15 引物或随机引物。特异性引物的浓度应根据反转录的种类进行调整。例如，当使用一个 24 个碱基的引物与 1.0 μg 的模板 RNA 杂交时，需要 800 ng（100 pmol） 引物。当相同的引物与总 RNA 样品中的特异性 RNA 杂交时，只需要少至 120 ng （15 pmol） 引物。特异性引物的典型长度为 19～30 个碱基。

2. 为了得到更长和 （或） 更丰富的转录本，可以将 cDNA 反应于 42 ℃，温育时间延长至 60 min。

3. 在 cDNA 合成时，与 M－MLV 反转录酶相比，AMV 反转录酶的用量要少很多。

4. 提高反转录的温度 （45～50 ℃），可以解决 RNA 二级结构的问题。