PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）

1．了解PCR-DGGE技术的原理。 2．了解并熟悉PCR-DGGE技术的步骤。

【实验原理】 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。 为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。 作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的 仪器 ，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

【实验用品】 1．PCR扩增仪；变性梯度凝胶电泳仪；凝胶成像及分析系统；紫外透射仪；高速离心机；电泳仪；电泳槽。 2．尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖 3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。Tip头盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。 4．PCR扩增相关 试剂 。

【实验步骤】 1．PCR反应（同前） 其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。 2．PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。 3．垂直变性梯度凝胶电泳 变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0～100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。 PCR产物加上样缓冲液后上样，300～400µl/孔，电压150V，温度60℃，时间2～4小时。 4．平行变性梯度凝胶电泳 变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。 PCR产物加上样缓冲液后，25μl～30μl/孔，电压150V，温度60℃，时间3～6小时。 5．染色5分钟， 凝胶成像 仪分析结果。

【实验结果分析】 观察并记录平行变性梯度凝胶上条带的位置，根据异常泳动变位筛查突变样本。

【思考题】 1． PCR-DGGE检测突变的基本原理是什么？ 2． 为什么要在上游5端添加[GC] Clamp？ 3． 如何确定样品的变性梯度？